專利名稱：用螺旋藻同源重組和表達人體基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種螺旋藻基因工程新技術(shù)，用以獲取同源重組和穩(wěn)定表達人體基因的螺旋藻轉(zhuǎn)化子。
背景技術(shù)：
迄今，螺旋藻的分子遺傳背景尚不清楚，國內(nèi)外僅先后從螺旋藻中克隆出藻藍蛋白、八氫番茄紅素合成酶等近10個基因，對螺旋藻基因組的序列和結(jié)構(gòu)知之甚少。在目前不了解螺旋藻基因組結(jié)構(gòu)和遺傳背景的情況下，如果去設(shè)計一個概念化的外源基因轉(zhuǎn)化螺旋藻的方法是不可操作的。研究者必須通過某一個具體的外源基因構(gòu)建出能與螺旋藻匹配、相容和重組的表達質(zhì)粒，采用有效的轉(zhuǎn)化方法，去創(chuàng)建螺旋藻的重組和表達體系。這是螺旋藻基因工程的難點。
螺旋藻基因工程的另一個難點是其沒有內(nèi)源質(zhì)粒，目前難以采用穿梭質(zhì)粒等基因工程方法進行外源基因的重組與表達。
TRAIL基因是人體腫瘤凋亡因子基因，它是1995年由Wiley克隆和命名的，屬于腫瘤壞死因子基因家族中的一個新成員。腫瘤壞死因子對腫瘤細胞具有強烈的致死作用、但其沒有選擇性，即對人體正常細胞同樣具有強烈的致死作用，故在臨床上難以應(yīng)用。TRAIL能夠誘導(dǎo)各種腫瘤細胞快速調(diào)亡，而對人體正常細胞無毒副作用，因而是一種具有重大臨床應(yīng)用前景的治癌新藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種在人體基因重組表達載體序列中連接螺旋藻同源片段，用以定點插入和整合到螺旋藻基因組中表達的方法。
螺旋藻具有原核光合特性，選擇與之匹配的高效調(diào)控元件是一重要關(guān)鍵技術(shù)，申請人采用高等植物葉綠體光合基因調(diào)控元件，因為葉綠體是真核細胞中的核外基因組，兼?zhèn)湓伺c真核的特性，一則能與螺旋藻的原核和光合特性匹配，同時又可與重組人體基因匹配。葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄單位通常是多順反子、基因排列方式、調(diào)控方式、GC堿基對含量以及翻譯所偏愛的密碼子與原核細胞相接近。葉綠體光合基因的啟動子既包含有相當(dāng)于原核的-10盒(TATACT)和-35盒(TTGACA)，同時在這兩個盒之間還存在著一個類似真核的TATA盒(TATATA)序列結(jié)構(gòu)。葉綠體光合基因啟動子不僅能表達原核基因，同時也能表達真核基因。這將會極大地拓寬螺旋藻基因重組和表達體系的功能。
螺旋藻若采用一般常規(guī)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法，如電擊轉(zhuǎn)化，化學(xué)轉(zhuǎn)化、超聲波轉(zhuǎn)化等都存在在極大的困難。因為這些常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法必須首先制備螺旋藻的單細胞原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體，即把螺旋藻絲體分離成單細胞，并要把細胞壁全部去除干凈，使細胞裸露而形成原生質(zhì)體。目前，這一技術(shù)在國內(nèi)外尚無成功先例，或是去壁不完全，或是去壁對細胞的損傷太大，或是原生質(zhì)體喪失再生能力。本發(fā)明避開了這一技術(shù)難點，不需要制備單細胞原生質(zhì)體，而采用適合的轟擊參數(shù)，直接用基因槍轉(zhuǎn)化螺旋藻絲體。
本發(fā)明可以通過以下方式來實現(xiàn)，均為無菌操作1、螺旋藻抗性標(biāo)記基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建(1)用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因作為螺旋藻的抗性基因，SalI酶切含有CAT基因表達盒的質(zhì)粒，回收CAT基因片段；(2)EcoRI酶切含葉綠體光合基因表達盒的質(zhì)粒，回收含有光合基因啟動子和終止子片段；(3)將以上獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得重組質(zhì)粒(I)。
2、含目的基因的抗性重組運載質(zhì)粒構(gòu)建(1)EcoRI酶切TRAIL基因文庫質(zhì)粒PBaCPAV-TRAIL，回收～600bp小片段，其為TRAIL基因不含編碼膜結(jié)合部分的片段；(2)XbaI酶切重組質(zhì)粒(I)；(3)將以上獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得含目的基因的抗性重組表達質(zhì)粒(II)。
3、螺旋藻同源片段的重組質(zhì)粒構(gòu)建(1)SalI、PstI酶切含有螺旋藻同源片段的質(zhì)粒，回收同源片段(2)PstI酶切質(zhì)粒PUC19，回收2686bp的大片段，其含β一半乳糖苷酶基因LacZ調(diào)控序列和前146個氨基酸編碼序列，在這個編碼區(qū)中插入一個多克隆酶切位點；(3)將以上獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得重組質(zhì)粒(III)。
4、含目的基因重組表達載體構(gòu)建(1)SalI、HindIII雙酶切重組質(zhì)粒(III)，回收含有同源片段和多克隆酶切位點的片段；(2)SalI酶切重組質(zhì)粒(II)，回收大片段；(3)用T4DNA連接酶連接以上的兩個片段后，獲得含目的基因的TRAIL的重組表達載體、～7000bp，其含的重組基因與元、部件為ST、CAT表達盒、psbApro-TRAIL-psbAter。
5、基因槍轉(zhuǎn)化(1)取對數(shù)生長期的無菌螺旋藻，接種于含雙抗的無菌培養(yǎng)液中，經(jīng)20～28h培養(yǎng)，接種到1.5～2.5％瓊脂固體培養(yǎng)基平板上；(2)采用適合的轟擊參數(shù)可裂膜800～1200psi，真空度24～28inHg，轟擊距離5～8cm，將金粉包裹的重組表達載體用基因槍轟擊和轉(zhuǎn)化平板上的螺旋藻體，然后轉(zhuǎn)入無抗生素的液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～10天。
6 螺旋藻轉(zhuǎn)化子的抗性傳代篩選用分別含有40～400μg/ml氯霉素從低濃度到高濃度連續(xù)多輪抗性傳代篩選，每輪持續(xù)20天以上，直至殺滅所有未轉(zhuǎn)化的螺旋藻，僅存螺旋藻轉(zhuǎn)化子藻體；將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入無氯霉素的培養(yǎng)液中恢復(fù)培養(yǎng)，以獲得螺旋藻轉(zhuǎn)化子種群培養(yǎng)物；對螺旋藻轉(zhuǎn)化子跟蹤進行Southern blot和Westernblot檢測，必需確證TRAIL陽性電泳雜交帶。
本發(fā)明創(chuàng)建的螺旋藻表達體系具有其獨特的優(yōu)勢。螺旋藻兼?zhèn)湮⑸锖透叩戎参锏膬?yōu)點，即其基因組為原核型，遺傳背景比較簡單，便于進行基因分析和外源DNA檢測；其細胞壁呈革蘭氏陰性，由肽聚糖組成，有利于外源基因?qū)?；其對光能的轉(zhuǎn)化率高達18％，生長速率大，是一種罕見的蛋白質(zhì)高效表達和合成體系，有利于外源基因的表達；同時，其營養(yǎng)價值很高，適于食用，有利于生產(chǎn)可食化的基因藥物。本發(fā)明把TRAIL基因重組到螺旋藻中進行表達，對開拓螺旋藻基因工程制藥具有重要的創(chuàng)新意義。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的描述。
1、螺旋藻抗性標(biāo)記基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建螺旋藻對氯霉素敏感，氯毒素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因適于作為螺旋藻轉(zhuǎn)化子的抗性篩選基因。(1)SalI酶切含有CAT基因表達盒的質(zhì)粒，回收CAT基因片段；(2)EcoRI酶切含葉綠體光合基因表達盒的質(zhì)粒，回收含有光合基因啟動子和終止子片段；(3)將以上獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得重組質(zhì)粒(I)。
2、含目的基因的抗性重組運載質(zhì)粒構(gòu)建TRAIL是一種膜蛋白，其一個末端序列插入膜內(nèi)。申請人所需TRAIL基因是不含編碼膜結(jié)合部分的功能片段，表達產(chǎn)物呈可溶性(1)EcoRI酶切TRAIL基因文庫質(zhì)粒PBaCPAV-TRAIL，回收～600bp小片段，其為TRAIL基因不含編碼膜結(jié)合部分的片段；(2)XbaI酶切重組質(zhì)粒(I)；(3)將獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得含目的基因的抗性重組表達質(zhì)粒(II)。
3、螺旋藻同源片段的重組質(zhì)粒構(gòu)建ST是螺旋藻的隨機同源片段(1)SalI、PstI酶切含有螺旋藻同源片段的質(zhì)粒，回收同源片段(2)PstI酶切質(zhì)粒PUC19，回收2686bp的大片段，其含β一半乳糖苷酶基因LacZ調(diào)控序列和前146個氨基酸編碼序列，在這個編碼區(qū)中插入一個多克隆酶切位點；(3)將以上獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得重組質(zhì)粒(III)。
4、含目的基因重組表達載體構(gòu)建(1)SalI、HindIII雙酶切重組質(zhì)粒(III)，回收含有同源片段和多克隆酶切位點的片段；(2)SalI酶切重組質(zhì)粒(II)，回收大片段；(3)用T4DNA連接酶連接以上的兩個片段后，獲得含目的基因的TRAIL的重組表達載體、～7000bp，其含的重組基因與元、部件為ST、CAT表達盒、psbApro-TRAIL-psbAter。
5、基因槍轉(zhuǎn)化(1)宿主螺旋藻的處理。取對數(shù)生長期的無菌螺旋藻，接種于含雙抗的無菌培養(yǎng)液中，經(jīng)24h培養(yǎng)，接種到2％瓊脂固體培養(yǎng)基平板上；(2)采用適合的轟擊參數(shù)可裂膜1000psi，真空度26inHg，轟擊距離6cm，將金粉包裹的重組表達載體用基因槍轟擊和轉(zhuǎn)化平板上的螺旋藻體，然后轉(zhuǎn)入無抗生素的液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天。
6 螺旋藻轉(zhuǎn)化子的抗性傳代篩選用分別含有40～400μg/ml氯霉素的Zarrouk培養(yǎng)液對上述螺旋藻進行連續(xù)多輪抗性傳代篩選，直至獲得轉(zhuǎn)化子(1)用低濃度氯霉素，在28C和光照條件下進行第一輪抗性傳代篩選；(2)20天后，將螺旋藻用中等濃度氯霉素的培養(yǎng)液中進行第二輪抗性傳代篩選；(3)20天后，再將螺旋藻用高濃度氯霉素的培養(yǎng)液中進行第三輪抗性傳代篩選，直至殺滅所有未轉(zhuǎn)化的螺旋藻，而僅存螺旋藻轉(zhuǎn)化子藻體；(4)將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入無氯霉素的培養(yǎng)液中恢復(fù)培養(yǎng)，以獲得螺旋藻轉(zhuǎn)化子種群培養(yǎng)物；(5)對螺旋藻轉(zhuǎn)化子跟蹤進行Southern blot和Western blot檢測，必需確證TRAIL陽性電泳雜交帶。
權(quán)利要求
1.用螺旋藻同源重組和表達人體基因的方法，其特征在于(1)螺旋藻抗性標(biāo)記基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建；(2)含目的基因的抗性重組運載質(zhì)粒構(gòu)建；(3)螺旋藻同源片段的重組質(zhì)粒構(gòu)建；(4)含目的基因重組表達載體構(gòu)建；(5)基因槍轉(zhuǎn)化；(6)螺旋藻轉(zhuǎn)化子的抗性傳代篩選。
2.依權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于螺旋藻抗性標(biāo)記基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建包括以下步驟(1)SalI酶切含有CAT基因表達盒的質(zhì)粒，回收CAT基因片段；(2)EcoRI酶切含葉綠體光合基因表達盒的質(zhì)粒，回收含有光合基因啟動子和終止子片段；(3)將以上獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得重組質(zhì)粒(I)。
3.依權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于含目的基因的抗性重組運載質(zhì)粒構(gòu)建包括以下步驟(1)EcoRI酶切TRAIL基因文庫質(zhì)粒PBaCPAV-TRAIL，回收～600bp小片段，其為TRAIL基因不含編碼膜結(jié)合部分的片段；(2)XbaI酶切重組質(zhì)粒(I)；(3)將以上獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得含目的基因的抗性重組表達質(zhì)粒(II)。
4.依權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于螺旋藻同源片段的重組質(zhì)粒構(gòu)建包括以下步驟(1)SalI、PstI酶切含有螺旋藻同源片段的質(zhì)粒，回收同源片段(2)PstI酶切質(zhì)粒PUC19，回收2686bp的大片段，其含β一半乳糖苷酶基因LacZ調(diào)控序列和前146個氨基酸編碼序列，在這個編碼區(qū)中插入一個多克隆酶切位點；(3)將以上獲得的片段用T4DNA連接酶連接后，獲得重組質(zhì)(III)。
5.依權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于含目的基因重組表達載體構(gòu)建包括以下步驟(1)SalI、HindIII雙酶切重組質(zhì)粒(III)，回收含有同源片段和多克隆酶切位點的片段；(2)SalI酶切重組質(zhì)粒(II)，回收大片段；(3)用T4DNA連接酶連接以上的兩個片段后，獲得含目的基因的TRAIL的重組表達載體、～7000bp，其含的重組基因與元、部件為ST、CAT表達盒、psbApro-TRAIL-psbAter。
6.依權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于基因槍轉(zhuǎn)化包括以下步驟(1)取對數(shù)生長期的無菌螺旋藻，接種于含雙抗的無菌培養(yǎng)液中，經(jīng)20～28h培養(yǎng)，接種到1.5～2.5％瓊脂固體培養(yǎng)基平板上；(2)將金粉包裹的重組表達載體用基因槍轟擊和轉(zhuǎn)化平板上的螺旋藻體，然后轉(zhuǎn)入無抗生素的液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～10天。
7.依權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于螺旋藻轉(zhuǎn)化子的抗性傳代篩選包括以下步驟(1)用分別含有40～400μg/ml氯霉素從低濃度到高濃度連續(xù)多輪抗性傳代篩選，每輪持續(xù)20天以上，直至殺滅所有未轉(zhuǎn)化的螺旋藻，僅存螺旋藻轉(zhuǎn)化子藻體；(2)將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入無氯霉素的培養(yǎng)液中恢復(fù)培養(yǎng)，以獲得螺旋藻轉(zhuǎn)化子種群培養(yǎng)物。
8.依權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于基因槍轟擊參數(shù)可裂膜800～1200psi，真空度24～28inHg，轟擊距離5～8cm。
9.依權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于抗性傳代篩選所得螺旋藻轉(zhuǎn)化子跟蹤進行Southern blot和Western blot檢測，必需確證TRAIL陽性電泳雜交帶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用基因槍把克隆和構(gòu)建的人體腫瘤凋亡因子TRAIL基因表達載體同源重組到螺旋藻基因組中進行穩(wěn)定表達的方法。重組TRAIL表達載體的特征性元部件包括抗性標(biāo)記基因表達盒CAT、葉綠體光合基因啟動子和終止子、螺旋藻同源片段、不含編碼膜結(jié)合部分的TRAIL基因片段等，這個表達系統(tǒng)兼?zhèn)湓撕驼婧说奶卣鳌ＴO(shè)定合適的轟擊參數(shù)，用基因槍把重組表達載體直接導(dǎo)入螺旋藻絲體，并經(jīng)多輪濃度遞增的氯霉素抗性連續(xù)傳代篩選和分子生物學(xué)檢測確證，得到TRAIL基因的螺旋藻轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明適用于用螺旋藻重組與表達人體基因，也適用于重組與表達其它原核和真核基因，這對螺旋藻的深度開發(fā)具有重要價值。
文檔編號C12N15/63GK1528902SQ20031011171
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
發(fā)明者錢凱先, 王勇, 蘇中亮, 曾文輝, 李江平, 王宏 申請人:廣東梅縣梅雁藍藻有限公司