用于阿爾茨海默氏病的診斷性miRNA標(biāo)志物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于阿爾茨海默氏病的診斷性mi RNA標(biāo)志物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于診斷阿爾茨海默氏病的新穎的標(biāo)志物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 最近，分子診斷學(xué)的重要性已經(jīng)日趨增加。已發(fā)現(xiàn)步入疾病的臨床診斷中（尤其 是，傳染性病原體的檢測(cè)、基因組的突變的檢測(cè)、患病細(xì)胞的檢測(cè)和疾病的誘因的風(fēng)險(xiǎn)因子 的鑒定）。
[0004] 尤其是，通過(guò)確定組織中的基因表達(dá)，核酸分析在疾病的研宄和診斷中打開(kāi)非常 有希望的新的可能性。
[0005] 待檢測(cè)的感興趣核酸包括基因組DNA、表達(dá)的mRNA和其他RNA諸如微小 RNA (簡(jiǎn)稱(chēng)miRNA)。miRNA是具有多種生物功能的新一類(lèi)小RNA (A. Kel Ier等人，Nat Methods. 20118(10) :841-3)。它們是見(jiàn)于真核細(xì)胞中的短的（平均具有20-24個(gè)核苷酸） 核糖核酸（RNA)分子。已在哺乳動(dòng)物中鑒定了幾百個(gè)不同種類(lèi)的微小RNA(即，幾百個(gè)不同 的序列）。它們對(duì)于轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是重要的，并與靶信使RNA轉(zhuǎn)錄物（mRNA)上的互補(bǔ)序 列相結(jié)合，這可導(dǎo)致翻譯阻抑或靶向降解和基因沉默。因此，它們還可用作研宄、診斷和治 療目的的生物標(biāo)志物。
[0006] 阿爾茨海默氏?。ˋD)，在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中也稱(chēng)作阿爾茨海默病，是最常見(jiàn)的癡呆形式。 阿爾茨海默氏病的特征為大腦皮層和某些皮層下區(qū)域中神經(jīng)元和突觸的喪失，并導(dǎo)致這些 區(qū)域中的嚴(yán)重變性。在AD中，由于受損組織中異常折疊的Α-β和tau蛋白的累積而導(dǎo)致 腦中的蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊和聚集（所謂"斑塊"的形成）。
[0007] 常將早期癥狀誤認(rèn)為是年齡相關(guān)的問(wèn)題。在早期階段，最常見(jiàn)的癥狀是難以記住 最近的事件。當(dāng)懷疑為AD時(shí)，通常利用評(píng)估行為和認(rèn)知能力的功能測(cè)驗(yàn)，常常接著進(jìn)行腦 成像分析來(lái)確認(rèn)診斷。用于該目的的成像方法包括計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)（CT)、磁共振成像 (MRI)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)（SPECT)、和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET)。在 已經(jīng)患有癡呆的患者中，與使用智力測(cè)驗(yàn)和醫(yī)學(xué)史分析的常見(jiàn)嘗試相比較，SPECT似乎在 區(qū)分阿爾茨海默氏病與其他可能的原因中是優(yōu)越的。已開(kāi)發(fā)了稱(chēng)作PiB PET的新技術(shù)，用 于利用選擇性結(jié)合淀粉狀蛋白沉積物的示蹤物直接和清楚地在體內(nèi)使淀粉狀蛋 白沉積物成像。最近，已提出了自血清進(jìn)行的miRNA診斷檢驗(yàn)（Geekiyanage et al.，Exp Neurol. 2012Jun ；235(2):491-6)〇
[0008] 癥狀可能與其他神經(jīng)疾患相似。診斷可能是耗時(shí)、昂貴和困難的。尤其是，基于非 侵入性分子標(biāo)志物的阿爾茨海默病的可靠且早期診斷仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。直至今日，AD的早期 診斷仍是巨大挑戰(zhàn)。迄今，尸體解剖或活組織檢查的發(fā)現(xiàn)代表該常見(jiàn)病的最可靠的診斷學(xué)。
[0009] 不僅在腦中，而且還在其他組織（例如皮膚）中報(bào)告β -淀粉狀蛋白的存在的 嘗試顯示了用于診斷AD的僅僅有限的相關(guān)性（Malaplate-Armand C, Desbene C, Pillot Τ, Olivier JL. Diagnostic biologique de la maladie (1? Alzheimer:avancees, limites et perspectives. Rev Neurol 2009;165:511-520)。因此，最近，已提出了不同的成像以 及體外診斷標(biāo)志物以提高AD診斷。最重要地是，集中于可在臨床前期階段檢測(cè)AD的生物 標(biāo)志物，然而，迄今僅在腦脊髓液（CSF)中可靠地檢測(cè)了這樣的標(biāo)志物。一個(gè)突出的例子 是β -淀粉狀蛋白-1-42和tau的組合。此外，已提出了患者的DNA中的單核苷酸多態(tài)性 的分子遺傳學(xué)分析以提供存在AD的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。除基因中的變體之外，幾項(xiàng)研宄已描述了 AD和線粒體DNA(mtDNA)的遺傳變異之間的關(guān)聯(lián)。目前，未能報(bào)道m(xù)tDNA變體和AD的關(guān) 系的一致的證據(jù)。Hudson G, Sims R, Harold D 等人；GERADlConsortium. No consistent evidence for association between mtDNA variants and Alzheimer disease. Neurology 2012 ;Neurology 2012 ;78:1038-104278:1038-1042。然而，雖然 AD 的遺傳可能性相當(dāng)高 (60-80% )，表觀遺傳學(xué)和持續(xù)因子也可起重要作用。
[0010]因此，對(duì)于用于AD的有效、簡(jiǎn)易、可靠的診斷檢驗(yàn)仍存在未滿足的需要。
[0011] 定義
[0012] 除非另外定義，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理 解的含義相同。
[0013] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"預(yù)測(cè)疾病的結(jié)果"意在包括在經(jīng)歷給定治療的患者的結(jié)果的 預(yù)測(cè)和不治療的患者的預(yù)后兩者。
[0014] 本發(fā)明的含義中的"結(jié)果"是在疾病的進(jìn)程中獲得的限定狀況。此疾病結(jié)果可以 例如是臨床狀況諸如"疾病的復(fù)發(fā)"、"疾病的消退"、"對(duì)治療的應(yīng)答"，疾病階段或等級(jí)或類(lèi) 似狀況。
[0015] "風(fēng)險(xiǎn)"被理解為受試者或患者發(fā)生或達(dá)到某種疾病結(jié)果的可能性。在本發(fā)明的上 下文中，術(shù)語(yǔ)"風(fēng)險(xiǎn)"并不意在指就患者的健康而言攜帶任何積極含義或消極含義，而僅指 發(fā)生或形成既定事件或狀況的或然性或可能性。
[0016] 術(shù)語(yǔ)"臨床數(shù)據(jù)"指與患者的健康狀況相關(guān)的可用數(shù)據(jù)和信息的總體，包括但不限 于，年齡、性別、重量、絕經(jīng)期/激素狀況、疾病發(fā)生學(xué)數(shù)據(jù)、既往病例（anamnesis)數(shù)據(jù)、通 過(guò)體外診斷方法諸如血檢或尿檢獲得的數(shù)據(jù)、通過(guò)成像方法獲得的數(shù)據(jù)，比如X-射線、計(jì) 算機(jī)斷層攝影術(shù)、MRI、PET、SpeCt、超聲、電生理學(xué)數(shù)據(jù)、遺傳分析、基因表達(dá)分析、活組織檢 查評(píng)估、外科手術(shù)發(fā)現(xiàn)。
[0017] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)患者的"樣品的分類(lèi)"指所述樣品與至少兩類(lèi)的至少一種的關(guān) 聯(lián)。這些種類(lèi)可以是例如"高風(fēng)險(xiǎn)"和"低風(fēng)險(xiǎn)"；或高、中等和低風(fēng)險(xiǎn)；其中風(fēng)險(xiǎn)是在某個(gè) 時(shí)期中發(fā)生某個(gè)事件的似然性，例如，疾病的發(fā)生、疾病的進(jìn)程等。它可進(jìn)一步意為疾病的 有利的或不利的臨床結(jié)果、對(duì)給定治療的反應(yīng)性或非反應(yīng)性等的種類(lèi)。分類(lèi)可通過(guò)利用算 法（尤其是判別函數(shù)）來(lái)進(jìn)行。算法的簡(jiǎn)單例子是根據(jù)第一定量參數(shù)的分類(lèi)，例如，高于或 低于某個(gè)閾值的感興趣核酸的表達(dá)水平。患者樣品的分類(lèi)可用于預(yù)測(cè)疾病的結(jié)果或發(fā)生疾 病的風(fēng)險(xiǎn)。代替利用感興趣的單一核酸的表達(dá)水平，可使用感興趣的若干核酸的組合評(píng)分。 此外，可將另外的數(shù)據(jù)與第一定量參數(shù)組合使用。所述另外的數(shù)據(jù)可以是來(lái)自患者的臨床 數(shù)據(jù)，比如性別、年齡、患者的重量、疾病分級(jí)等。
[0018] "判別函數(shù)"是用于分類(lèi)對(duì)象或事件的一組變數(shù)的函數(shù)。因此，判別函數(shù)允許根據(jù) 可從患者、樣品或事件可獲得的數(shù)據(jù)或參數(shù)將所述患者、樣品或事件分類(lèi)為一個(gè)種類(lèi)或多 個(gè)種類(lèi)。該分類(lèi)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)手段。例如，根據(jù)從所述患者、 樣品或事件中獲得的數(shù)據(jù)可將患者分類(lèi)為"高風(fēng)險(xiǎn)"或"低風(fēng)險(xiǎn)"、"需要治療"或"不需要治 療"或其它種類(lèi)。分類(lèi)不限于"高對(duì)低"，而是可以實(shí)施分類(lèi)成多個(gè)種類(lèi)、分級(jí)等。允許分類(lèi) 的判別函數(shù)的例子包括但不限于由支持向量機(jī)（support vector machine, SVM)、k-最近鄰 (k-nearest-neighbor,kNN)、（樸素（naive))貝葉斯模型定義的判別函數(shù)，或分段定義的 函數(shù)，諸如例如在子集發(fā)現(xiàn)、決策樹(shù)、數(shù)據(jù)的邏輯分析（LAD)等中的。
[0019] 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)水平"指例如感興趣核酸的確定的水平表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)水平的模式 (pattern)"指與來(lái)自參照核酸（例如來(lái)自對(duì)照）相比較，或與計(jì)算的平均表達(dá)值（例如在 DNA芯片分析中）相比較的確定的表達(dá)水平。模式不限于兩種基因的比較，而且還涉及基因 與參照基因或樣品的多重比較。某個(gè)"表達(dá)水平的模式"也可作為結(jié)果并通過(guò)下文公開(kāi)的 感興趣的若干核酸的比較和測(cè)量來(lái)確定，并展示出這些轉(zhuǎn)錄物彼此的相對(duì)豐度。表達(dá)水平 還可相對(duì)于不同組織，患者對(duì)健康對(duì)照等中的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)。
[0020] 本發(fā)明的含義中的"表達(dá)水平的參照模式"應(yīng)理解為可用于與另一表達(dá)水平模式 相比較的任何表達(dá)水平模式。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)水平的參照模式是 例如在充當(dāng)參照組的一組健康或患病個(gè)體中觀察到的平均表達(dá)水平模式。
[0021] 在本發(fā)明的上下文中，"樣品"或"生物樣品"是源自生物學(xué)生物體或已同生物學(xué)生 物體相接觸的樣品。生物樣品的例子是：細(xì)胞、組織、體液、活組織檢查樣本、血液、尿液、唾 液、痰液、血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液，和其他。
[0022] "探針"是能夠與特定生物分子特異性結(jié)合或相互作用的分子或物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"引 物"、"引物對(duì)"或"探針"應(yīng)具有分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些術(shù)語(yǔ)的常規(guī)含義。在 本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，"引物"、"引物對(duì)"和"探針"指具有下述序列的寡核苷酸或多 核苷酸分子，所述序列與待檢測(cè)或定量的靶分子或靶序列的區(qū)域相同、互補(bǔ)、作為該區(qū)域的 同源物、或同源，從而引物、引物對(duì)或探針可特異性地與靶分子結(jié)合，所述靶分子例如，待檢 測(cè)或待定量的靶核酸、RNA、DNA、cDNA、基因、轉(zhuǎn)錄物、肽、多肽或蛋白。如本文所理解的，弓丨 物可自身發(fā)揮探針功能。如本文所理解的，"探針"還可包含例如引物對(duì)和內(nèi)部標(biāo)記探針的 組合，其是許多商品化qPCR方法中所常見(jiàn)的。
[0023] "基因"是包含以受控的方式產(chǎn)生功能性的RNA產(chǎn)物所需的信息的核酸區(qū)段區(qū)。"基 因產(chǎn)物"是通過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)產(chǎn)生的生物分子，例如，mRNA或翻譯的蛋白。
[0024] "miRNA"是短的、天然存在的RNA分子，并應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的一般含 義。"源自miRNA的分子"是以化學(xué)方法或酶促方法獲自miRNA模板的分子，比如cDNA。
[0025] 術(shù)語(yǔ)"陣列"指裝置（例如，芯片裝置）上可尋址的位置的排列。位置的數(shù)目可從 幾個(gè)變化到至少幾百或幾千個(gè)。每個(gè)位置代表獨(dú)立的反應(yīng)位點(diǎn)。陣列包括但不限于核酸陣 列、蛋白陣列和抗體陣列。"核酸陣列"指含有核酸探針（比如寡核苷酸、多核苷酸或基因的 較大部分）的陣列。陣列上的核酸優(yōu)選為單鏈的。"微陣列"指生物芯片或生物學(xué)芯片，即 具有至少約100/cm2密度的含固定探針的離散區(qū)域的區(qū)域陣列。
[0026] "基于PCR的方法"指包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的方法。這是通過(guò)利用一種、兩種 或更多種引物在體外酶促?gòu)?fù)制指數(shù)擴(kuò)增核酸（例如DNA或RNA)的方法。對(duì)于RNA擴(kuò)增，可 使用逆轉(zhuǎn)錄作為第一步?；赑CR的方法包含動(dòng)力學(xué)或定量PCR(qPCR)，其特別適宜于分 析表達(dá)水平）。當(dāng)其實(shí)現(xiàn)表達(dá)水平的確定時(shí)，可例如使用基于PCR的方法以檢測(cè)給定mRNA 的存在，其通過(guò)（1)在逆轉(zhuǎn)錄酶的協(xié)助下將完整的mRNA庫(kù)（所謂的轉(zhuǎn)錄物組）逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并（2)在相應(yīng)的引物的協(xié)助下檢測(cè)給定cDNA的存在進(jìn)行。該方法通常稱(chēng)作逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR(rtPCR)。術(shù)語(yǔ)"基于PCR的方法"包含端點(diǎn)PCR應(yīng)用及應(yīng)用特別的熒光團(tuán)或嵌入染料 的動(dòng)力學(xué)/實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，所述熒光團(tuán)或嵌入染料發(fā)射熒光信號(hào)作為擴(kuò)增的靶標(biāo)的函數(shù)，并 允許進(jìn)行靶標(biāo)的監(jiān)測(cè)和定量。定量方法可以根據(jù)外部標(biāo)準(zhǔn)曲線是絕對(duì)的或相對(duì)于比較性?xún)?nèi) 部標(biāo)準(zhǔn)品。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"下一代測(cè)序"或"高通量測(cè)序"指使測(cè)序方法平行化，一次產(chǎn)生幾千個(gè)或 幾百萬(wàn)個(gè)序列的高通量測(cè)序技術(shù)。例子包括大規(guī)模平行標(biāo)簽測(cè)序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、Polony 測(cè)序、454 焦磷酸測(cè)序、Illumina(Solexa)測(cè) 序、SOLiD測(cè)序、離子半導(dǎo)體測(cè)序、DNA納米球測(cè)序、Helioscope(TM)單分子測(cè)序、單分子 SMRT(TM)測(cè)序、單分子實(shí)時(shí)（RNAP)測(cè)序、納米孔DNA測(cè)序。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"標(biāo)志物"或"生物標(biāo)志物"指可檢測(cè)其存在或濃度并與已知的病狀（比如疾 病狀態(tài)）或與臨床結(jié)果（比如對(duì)治療的應(yīng)答）相關(guān)聯(lián)的生物分子，例如，核酸、肽、蛋白、激 素等。
[0029] 發(fā)明目的
[0030] 本發(fā)明根本的技術(shù)問(wèn)題是提供允許診斷、篩查或監(jiān)測(cè)阿爾茨海默氏病、預(yù)測(cè)發(fā)生 阿爾茨海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)測(cè)阿爾茨海默氏病的結(jié)果的生物學(xué)標(biāo)志物。
[0031] 發(fā)明概述
[0032] 在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所描述的方法的過(guò)程步驟的特定的 組分部分，因?yàn)檫@樣的方法可能變化。還應(yīng)理解的是，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定的實(shí) 施方案的目的，并不意在進(jìn)行限制。必須注意的是，除非文中另外清楚地指明，如本說(shuō)明書(shū) 和所附權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式"一（a/an)"、"該"包括單數(shù)和/或復(fù)數(shù)指代物。還應(yīng) 理解的是，除非文中另外清楚指明，復(fù)數(shù)形式包括單數(shù)和/或復(fù)數(shù)指代物。更應(yīng)理解的是， 在給出由數(shù)值劃定的參數(shù)范圍的情況下，視為該范圍包括這些限值。
[0033] 概括而言，本發(fā)明涉及可用于阿爾茨海默氏病的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)的miRNA標(biāo)志 物集合。
[0034] 尤其是，本發(fā)明涉及分類(lèi)罹患或有風(fēng)險(xiǎn)形成阿爾茨海默氏病的患者的樣品的方 法，其中所述樣品是血液樣品，所述方法包括以下步驟：
[0035] a)在所述樣品中確定選自下組的至少一種miRNA的表達(dá)水平：具有序列SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 1 到 SEQ ID NO