一種預(yù)示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標(biāo)記方法及其分子標(biāo)記引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用分子標(biāo)記預(yù)示和鑒定綿羊 超數(shù)排卵性狀的方法。
【背景技術(shù)】
[000引超數(shù)排卵（MultipleOvulation,MO)技術(shù)是近30年來國際上發(fā)展很快的一項(xiàng)生 物高新技術(shù)，在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家，羊的超數(shù)排卵技術(shù)自上世紀(jì)末就已從實(shí)驗(yàn)室逐步轉(zhuǎn)入了 應(yīng)用階段。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用使人們擺脫了過去對(duì)雌性動(dòng)物的生殖研究和應(yīng)用的限制，開始 挖掘和利用優(yōu)良母畜的遺傳潛力，利用該項(xiàng)技術(shù)可W在相對(duì)較短的時(shí)間里，從一只母羊獲 得更多的后代，它可W比傳統(tǒng)的方法加快幾倍、幾十倍繁殖優(yōu)良種羊，該將大大提高優(yōu)良種 群的繁殖效率，促進(jìn)家畜改良，加速遺傳進(jìn)展；同時(shí)也為生殖細(xì)胞融合、體外受精、胚胎性別 鑒定、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、體細(xì)胞克隆等生物技術(shù)的研究提供基礎(chǔ)，是上世紀(jì)繼人工授精之后家畜 繁殖領(lǐng)域的又一次重大革命。
[0003] 隨著超數(shù)排卵技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中和科研工作中的廣泛開展，一些影響其進(jìn)一步發(fā) 展和提高的技術(shù)問題也日益顯現(xiàn)。超數(shù)排卵效果不穩(wěn)定已成為制約其進(jìn)一步推廣應(yīng)用的首 要因素，即使供體母羊的品種、年齡、營養(yǎng)及生理狀況，激素的來源、劑量，超數(shù)排卵的季節(jié)、 程序等均相同的情況下，超數(shù)排卵效果仍然會(huì)出現(xiàn)很大程度的差異，不同個(gè)體在獲卵數(shù)上 變異很大，變異系數(shù)在40%左右，導(dǎo)致超數(shù)排卵的效率顯著下降。
[0004] 隨著現(xiàn)代分子遺傳學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)為解決該一問題提供了新的 思路。采用分子生物學(xué)技術(shù)方法可W避免年齡和環(huán)境的干擾來實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記的基因型檢 巧。，利用分子標(biāo)記基因型信息可W準(zhǔn)確的選擇優(yōu)質(zhì)供體參加超數(shù)排卵處理，減小獲卵數(shù)變 異，該樣必將極大地加快育種進(jìn)程，提高家畜生產(chǎn)效率。
[0005]促卵泡激素又名卵泡刺激素（Follicle-StimulatingHormone,FSH)，在生殖過程 中扮演著重要的角色，同時(shí)也是超數(shù)排卵處理過程中最為重要的一種外源補(bǔ)充激素。但促 卵泡激素本身不能直接透過細(xì)胞膜，必須與祀組織的顆粒細(xì)胞、內(nèi)膜細(xì)胞上的促卵泡激素 受體（F甜rec巧tor,FSHR)結(jié)合，才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)作用。綿羊FS皿基因位于 3號(hào)染色體，Yarney等（1993)首先克隆了其cDNA序列，此序列包括長2085bp的開放閱讀 框，編碼678個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)（74, 580daltons;pl= 6. 78)。與已知的人和大鼠的 序列同源性超過90%。FS皿的mRNA位于卵泡顆粒細(xì)胞的表面，在卵泡發(fā)育初期、卵泡內(nèi)膜 和基質(zhì)膜形成W前，原始卵泡只有1~2層顆粒細(xì)胞時(shí)就能發(fā)現(xiàn)。FSHR與其配體結(jié)合，使顆 粒細(xì)胞或睪丸細(xì)管滋養(yǎng)層細(xì)胞cAMP濃度升高，使蛋白激酶A(PKA)活化，導(dǎo)致一些蛋白酶和 轉(zhuǎn)錄因子激活。轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白和cAMP反應(yīng)結(jié)合效應(yīng)物被PKA磯酸化而 激活，與CRE(cAMP反應(yīng)元件）結(jié)合，導(dǎo)致特定階段的mRNA轉(zhuǎn)錄。
[0006] 因此，促卵泡激素受體基因（FSHR)可W被選定為候選基因，通過尋找其具有重要 功能的分子標(biāo)記，并利用分子標(biāo)記信息進(jìn)行供體選擇，對(duì)于提高綿羊超數(shù)排卵效率具有重 要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克隆綿羊促卵泡激素受體（FSHR)基因片段，鑒定其特定的突 變位點(diǎn)，而提供一種預(yù)示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標(biāo)記方法及其分子標(biāo)記引物。
[000引本發(fā)明根據(jù)綿羊FS皿基因5f調(diào)控區(qū)C.-3650T突變（C-365T)，采用引物單堿基 錯(cuò)配方式，巧妙設(shè)計(jì)了特異性引物FSHRPF和FSHRPR，成功屏蔽掉引物區(qū)域內(nèi)基因組上的原 有干擾酶切位點(diǎn)，只保留擴(kuò)增區(qū)段中用于C-365T突變檢測的酶切位點(diǎn)。采用限制性內(nèi)切酶 Sau3AI對(duì)C-365T突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測分型，利用基因型信息與綿羊超數(shù)排卵性狀的關(guān)聯(lián)性， 提供一種預(yù)示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標(biāo)記方法。
[0009] 本發(fā)明提供一種預(yù)示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標(biāo)記引物，該分子標(biāo)記引物 為F甜RPF和F甜RPR，F(xiàn)細(xì)RPF的序列如序列表SeqIDNo;1所示，F(xiàn)甜RPR的序列如序列表 SeqIDNo;2 所示。
[0010] 本發(fā)明的一種預(yù)示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標(biāo)記方法，它是按照W下步驟 進(jìn)行的：
[0011] 一、W提取的綿羊基因組DNA為模板，采用FSHRPF和FSHWR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 收集PCR產(chǎn)物；取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，并采用Sau3AI限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn) 行酶切，獲得酶切產(chǎn)物；
[0012] 二、使用濃度為3%的瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，然后根據(jù)電泳分離結(jié)果 進(jìn)行基因型判定；判定的標(biāo)準(zhǔn)為：①電泳后呈現(xiàn)單一條帶，大小為138bp，則綿羊FS皿基因 5 ^調(diào)控區(qū)段-365位點(diǎn)未突變，堿基為C，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能夠被限制性內(nèi)切酶Sau3AI酶 切，將其命名為AA基因型；②電泳后呈現(xiàn)兩條帶，大小分別為138bp和26bp，則綿羊FS皿基 因5 ^調(diào)控區(qū)段-365位點(diǎn)發(fā)生突變，堿基為T，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能夠被限制性內(nèi)切酶Sau3AI 完全酶切，將其命名為BB基因型；⑨電泳后呈現(xiàn)S條帶，大小分別為138bp，112bp和26bp， 貝IJ綿羊FS皿基因5M周控區(qū)段-365位點(diǎn)處于雜合狀態(tài)，堿基為C和T，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只能 夠被限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切，將其命名為AB基因型；
[0013] S、構(gòu)造W下線性模型；Y=y+G+L+H+6 ;其中；Y代表相關(guān)性狀的記錄值；y代表 群體的平均值；G代表基因型固定效應(yīng)；L代表品種固定效應(yīng)；H代表場年季固定效應(yīng)；e代 表隨機(jī)殘差效應(yīng)；然后利用SAS6. 12軟件包將基因型固定效應(yīng)與超數(shù)排卵狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分 析，并估計(jì)性狀的最小二乘均值，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，對(duì)于卵巢上排卵點(diǎn)數(shù)量，各基因型群 體間為BB>AB>AA;BB型群體綿羊胚胎受精率和優(yōu)良胚胎率的均值高于AA型和AB型群 體；在移植妊娠率方面，WAB型群體均值最高；
[0014] 四、依據(jù)基因型將綿羊供體分為S種類型，選擇BB基因型綿羊供體參與超數(shù)排卵 處理，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)綿羊超數(shù)排卵數(shù)的分子標(biāo)記輔助選擇，即完成預(yù)示和鑒定綿羊超數(shù)排卵 性狀的分子標(biāo)記方法；所述的FSHRPF的序列如序列表SeqIDNo;1所示，F(xiàn)SHWR的序列如 序列表SeqIDNo;2所示。
[00巧]本發(fā)明的F甜RPF引物序列為：AGCGAGAGAGACATCAGTGAC'FSHRPR引物序列為； GCAGTGTGAAACATCATTAAGA〇
[0016] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0017] 本發(fā)明最主要的特點(diǎn)是；1、利用綿羊FS皿基因5f調(diào)控區(qū)的C-365T突變與綿 羊超數(shù)排卵性狀的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)行預(yù)示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀；2、本發(fā)明在設(shè)計(jì)分子標(biāo) 記引物中，采用引入單堿基錯(cuò)配方式，屏蔽掉引物區(qū)域內(nèi)基因組上的原有干擾酶切位點(diǎn)， 只保留擴(kuò)增區(qū)段中用于C-365T突變檢測的酶切位點(diǎn)，使本發(fā)明的分子標(biāo)記方法能夠進(jìn)行 PCR-RLFP分析，具有費(fèi)用低，準(zhǔn)確率高的優(yōu)勢。
[0018] 本發(fā)明的方法操作簡單，檢測費(fèi)用低，精確度高，并適合于自動(dòng)化檢測。使用本發(fā) 明的分子標(biāo)記方法完成綿羊超數(shù)排卵過程中供體的選擇，獲卵數(shù)提高2. 87枚，減小了性狀 的變異，提高了綿羊超數(shù)排卵的效率。應(yīng)用本發(fā)明方法進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，必將極大地 加快育種進(jìn)程，提高綿羊生產(chǎn)效率。并為生殖細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、體細(xì)胞克隆等生物技 術(shù)的研究提供更多的優(yōu)質(zhì)卵子。
【附圖說明】
[0019] 圖1為綿羊FS皿基因5 ^調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié) 果。其中，M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker, 1-10泳道為被檢測的10個(gè)PCR產(chǎn)物。
[0020] 圖2為綿羊FS皿基因5 ^調(diào)控區(qū)段C-365T多態(tài)位點(diǎn)酶切分型結(jié)果。其中，M泳 道為標(biāo)準(zhǔn)分子量13'1?51'，1、3、5、7、9、10泳道為44型個(gè)體，2、4、6泳道為48型個(gè)體，8泳道 為BB型個(gè)體。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0021] 一；本實(shí)施方式的一種預(yù)示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標(biāo)記引 物，該分子標(biāo)記引物為FSHRPF和FSHRPR，F(xiàn)SHRPF的序列如序列表SeqIDNo;1所