分子量Marker，1、3、5、7、9、10泳道 為AA型個體，2、4、6泳道為AB型個體，8泳道為BB型個體。
[0069] 5、綿羊FSHR基因5 ^調控區(qū)C-365T突變位點多態(tài)性分布檢驗
[0070] 在6個實驗群體中，根據(jù)酶切分型檢測結果，分析了綿羊FS皿基因5 ^調控區(qū) C-365T突變位點的各種基因型頻率和基因頻率，統(tǒng)計結果見表1。如表所示，6個品種只有 薩?？搜蛉后w中未檢測出BB型個體，其它品種中S種基因型均有分布。獨立性檢驗狂2)總 體結果表明，品種間基因型頻率差異顯著（P<〇. 05)。
[0071] 表1.基因型和基因頻率在不同品種間比較
[0072]
[0074] 6、綿羊FS皿基因5 M周控區(qū)C-365T突變位點多態(tài)性與超數(shù)排卵各指標間的相關 分析
[0075] 將綿羊FS皿基因5 ^調控區(qū)C-365T突變位點的基因型，與相應群體中綿羊的超 數(shù)排卵各指標進行關聯(lián)分析，見表2。結果表明：對于卵巢上排卵點數(shù)量，各基因型群體間 有BB>AB>AA，不同基因型對卵巢上排卵點數(shù)量存在顯著的影響（P<0.05) ;BB型群體綿 羊胚胎受精率和優(yōu)良胚胎率的均值高于AA型和AB型群體，但差異不顯著（P〉0. 05)。在移 植妊娠率方面，WAB型群體均值最高，但S種基因型間差異不顯著（P〉0. 05)。
[0076] W上結果表明，F(xiàn)SHR基因可作為綿羊超數(shù)排卵獲卵數(shù)性狀的主要候選基因之一， 通過選擇BB基因型供體參與超數(shù)排卵處理，其排卵數(shù)高于AA型供體2. 87枚。BB基因型可 W作為分子遺傳標記用于預測綿羊超數(shù)排卵的排卵數(shù)，將顯著的提高綿羊超數(shù)排卵效率。
[0077] 表2.各種基因型與超數(shù)排卵各指標間關聯(lián)分析 [007引
〇
【主權項】
1. 一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記方法，其特征在于該分子標記方法是 利用綿羊FSHR基因5 '調控區(qū)c.-365的C>T突變位點進行分型，從而預示和鑒定綿羊超 數(shù)排卵性狀。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記方法，其特征 在于預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀是按照以下步驟進行的： 一、以提取的綿羊基因組DNA為模板，采用FSHRPF和FSHRPR引物，進行PCR擴增，收集 PCR產物；取PCR產物進行凝膠電泳檢測，并采用Sau3AI限制性內切酶對PCR產物進行酶 切，獲得酶切產物； 二、 使用濃度為3%的瓊脂糖凝膠對酶切產物進行分離，然后根據(jù)電泳分離結果進行基 因型判定；判定的標準為：①電泳后呈現(xiàn)單一條帶，大小為138bp，則綿羊FSHR基因5 '調 控區(qū)段-365位點未突變，堿基為C，PCR擴增產物不能夠被限制性內切酶Sau3AI酶切，將其 命名為AA基因型；②電泳后呈現(xiàn)兩條帶，大小分別為138bp和26bp，則綿羊FSHR基因V 調控區(qū)段-365位點發(fā)生突變，堿基為T，PCR擴增產物能夠被限制性內切酶Sau3AI完全酶 切，將其命名為BB基因型；③電泳后呈現(xiàn)三條帶，大小分別為138bp，112bp和26bp，則綿羊 FSHR基因5 '調控區(qū)段-365位點處于雜合狀態(tài)，堿基為C和T，PCR擴增產物只能夠被限 制性內切酶Sau3AI部分酶切，將其命名為AB基因型； 三、 構造以下線性模型：Y=y+G+L+H+e;其中：Y代表相關性狀的記錄值；y代表群體 的平均值；G代表基因型固定效應；L代表品種固定效應；H代表場年季固定效應；e代表隨 機殘差效應；然后利用SAS6. 12軟件包將基因型固定效應與超數(shù)排卵狀進行關聯(lián)分析，并 估計性狀的最小二乘均值，關聯(lián)分析結果表明，對于卵巢上排卵點數(shù)量，各基因型群體間為 BB>AB>AA;BB型群體綿羊胚胎受精率和優(yōu)良胚胎率的均值高于AA型和AB型群體；在 移植妊娠率方面，以AB型群體均值最高； 四、 依據(jù)基因型將綿羊供體分為三種類型，選擇BB基因型綿羊供體參與超數(shù)排卵處 理，從而實現(xiàn)對綿羊超數(shù)排卵數(shù)的分子標記輔助選擇，即完成預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性 狀的分子標記方法；所述的FSHRPF的序列如序列表SeqIDNo:1所示，F(xiàn)SHRPR的序列如序 列表SeqIDNo:2所示。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記方法，其特征 在于步驟三構造線性模型是依據(jù)實驗群體的特點，所述的實驗群體的特點為：①32只澳洲 美利奴品種，28只德國肉用美利奴品種，19只薩?？似贩N，16只特克塞爾品種，14只夏洛萊 品種，36只東北細毛羊；②均為母羊；③所有結果為三年內分析完成。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記方法，其特征 在于步驟三中的關聯(lián)分析結果表明：對于卵巢上排卵點數(shù)量，各基因型群體間為BB>AB> AA;不同基因型對卵巢上排卵數(shù)量存在顯著的影響，其中，P〈0. 05 ;BB型群體綿羊胚胎受精 率和優(yōu)良胚胎率的均值高于AA型和AB型群體，但差異不顯著，其中，P>0. 05 ;在移植妊娠率 方面，以AB型群體均值最高，但三種基因型間差異不顯著，其中，P>0. 05。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記方法，其特征 在于步驟一中PCR擴增體系為20y1，PCR反應體系如下： 體系 用量 投板DNA(lOOng^il) 1.0^1 引物FSHRPF(lOpmol/pl) 1.5^1 I物FSHRPR( 10pmol/(_il) 1.5^1 l〇xPCRBuffer 2.0^1 dN'TPMixture(4><2.5mmol/L) 2.0)il TaqDNA聚介酚（5U/.ul) 0.5^1 ddH20 115ixl PCR擴增條件為：94°C預變性5min，94°C變性30s，59°C退火30s，72°C延伸30s，共30個 循環(huán)，再72°C延伸7min，4°C保溫。6. 根據(jù)權利要求1所述的一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記方法，其特征 在于步驟一中采用Sau3AI限制性內切酶進行酶切的體系為10. 0y1，反應體系如下： 體系 用量 PCR產物 3.0^1 Sau3AIlOxbulTcr 1.0)iL Sau3AI內W_(10U,VI) 0.5(iL ddH20 5.5^1 酶切反應條件為：37°C酶切12h。7. 根據(jù)權利要求1所述的一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記方法，其特 征在于步驟一中采用Sau3AI限制性內切酶對PCR產物進行酶切是指使用限制性內切酶 Sau3AI對PCR產物的C-365T突變位點進行酶切。8. -種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記引物，其特征在于該分子標記引物為 FSHRPF和FSHRPR，F(xiàn)SHRPF的序列如序列表SeqIDNo:1所示，F(xiàn)SHRPR的序列如序列表Seq IDNo: 2 所示。9. 根據(jù)權利要求8所述的一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記引物，其特征 在于所述的分子標記引物中的是FSHRPF引物通過以下方式設計的：采用引物單堿基錯配 方式，在FSHRPF引物序列上設計CATC堿基，屏蔽掉引物區(qū)域內基因組上的Sau3AI干擾酶 切位點，只保留用于C-365T突變檢測的酶切位點。
【專利摘要】一種預示和鑒定綿羊超數(shù)排卵性狀的分子標記方法及其分子標記引物，它公開了一種分子標記方法。本發(fā)明是利用綿羊FSHR基因5＇調控區(qū)c.-365的C>T突變(C-365T)突變位點設計，分子標記引物為FSHRPF和FSHRPR。方法為：一、用引物擴增綿羊FSHR基因5＇調控區(qū)段；二、使用Sau3AI對PCR擴增片段內C-365T突變位點進行酶切檢測；三、進行基因型判定；四、構造線性模型進行關聯(lián)分析；BB基因型供體在超數(shù)排卵過程中具有更高的排卵數(shù)，擁有更高的超數(shù)排卵效率。本發(fā)明操作簡單，檢測費用低，精確度高，適合于自動化檢測。本發(fā)明利用FSHR基因5＇調控區(qū)段的基因型信息與綿羊超數(shù)排卵性狀的關聯(lián)性。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN104988238
【申請?zhí)枴緾N201510446375
【發(fā)明人】姚玉昌, 亓美玉, 陸明海, 宋旭婷, 王素梅, 李武
【申請人】東北農業(yè)大學
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月27日