0052] 稀釋緩沖液為含I. 5mg/mLNa2C03、2. 93mg/mlNaHCO3的PH為 9. 6 的 0? 05M碳酸 鹽緩沖液；
[0053] 酶標(biāo)抗體為HRP酶標(biāo)抗體；
[0054] 終止液為：將21. 7ml的2MH2SO4定容至200ml的ddH20中；
[0055] 洗脫液為含木瓜蛋白酶的PH為8. 0的0.lmol/LTris-HCL緩沖液；
[0056] 酸化劑為硝酸；
[0057] 上樣緩沖液為含有IMTris-HCl(pH6. 8) 15. 5mL、1 %溴酚藍 2. 5mL、ddH207mL、甘 氨酸 25mL的Samplebuffer(5X);
[0058] 電泳緩沖液為含Tris3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH為6. 8的ddH20溶液。
[0059] 本發(fā)明提供一種汞-纖維蛋白原螯合物，汞離子與纖維蛋白原通過巰基或/和半 胱氨酸殘基螯合而成。
[0060] 本發(fā)明還提供一種汞-纖維蛋白原螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0061] A)汞與纖維蛋白原的螯合反應(yīng)：在人源的纖維蛋白原中加入汞離子進行螯合反 應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0062] B)純化汞-纖維蛋白原螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未 反應(yīng)的纖維蛋白原以及多余的汞離子，即得汞-纖維蛋白原螯合物，具體步驟如下：
[0063] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使汞-纖維蛋白原 螯合物復(fù)溶；
[0064](2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維 蛋白原特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；所述能與纖維蛋白原 特異性結(jié)合的填料為含抗纖維蛋白原抗體的硅膠或樹脂；
[0065] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，纖維蛋 白原與填料特異性結(jié)合；
[0066] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液I;
[0067] (5)收集：收集洗脫液I
[0068] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0069] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與汞特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；所述能與汞特異性結(jié)合的填 料為含抗汞抗體的硅膠或樹脂；
[0070] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0071] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液II;
[0072] (10)收集：收集洗脫液II
[0073] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用2升CldH2O透析除鹽，換 水三次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得汞-纖維蛋白原螯合物；
[0074] C)對汞-纖維蛋白原螯合物的鑒定，具體步驟如下：
[0075] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0076] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的汞-纖維蛋白原螯合物，加入稀釋緩沖液， 并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0077] (3)電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0078] (4)檢測：在膠床上找出含汞的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有汞以及檢測汞的含量。
[0079] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的汞-纖維蛋白原螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑 盒。
[0080] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)或捕獲 汞的物質(zhì)。
[0081] 在本發(fā)明中，能實現(xiàn)本發(fā)明目的的試劑盒可以列出以下幾種，但并不限于此。
[0082] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括含有捕獲纖維蛋白原的物 質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、作為二抗的可捕獲汞的物質(zhì)、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、稀釋緩 沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0083] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括含有捕獲纖維蛋白原的物 質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、洗脫液、陽性對照、陰性對照等。
[0084] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括含有捕獲纖維蛋白原的物 質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、洗脫液、酸化劑、過氧化氫、陽性對照、陰性對照等。
[0085] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括作為提純?nèi)欣w維蛋白 原所需提取試劑、復(fù)溶液、含有捕獲汞的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)抗體、底物、終 止液、稀釋緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0086] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括作為提純?nèi)欣w維蛋白 原所需提取試劑、復(fù)溶液、陽性對照、陰性對照等。
[0087] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括作為提純?nèi)欣w維蛋白 原所需提取試劑、復(fù)溶液、酸化劑、過氧化氫、陽性對照、陰性對照等。
[0088] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括作為提純?nèi)欣w維蛋白 原的提取試劑、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含汞的蛋白條帶所需液體、含有 捕獲汞的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、稀釋緩沖液、陽性對照、 陰性對照等。
[0089] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括作為提純?nèi)欣w維蛋白 原所需提取試劑、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含汞的蛋白條帶所需液體、陽 性對照、陰性對照等。
[0090] -種檢測血樣中汞-纖維蛋白原螯合物的試劑盒，包括作為提純?nèi)欣w維蛋白 原所需提取試劑、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含汞的蛋白條帶所需液體、酸 化劑、過氧化氫、陽性對照、陰性對照等。
[0091] 上述幾種試劑盒中，所述陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)品，即螯合有重金屬汞的纖維蛋白原螯 合物或螯合有重金屬汞的BSA螯合物；所述陰性對照為不含有標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋緩沖液。
[0092] 上述試劑盒用于檢測螯合汞的纖維蛋白原，以提高檢測的準(zhǔn)確性，重復(fù)性，并使之 在臨床中得到推廣。
[0093] 本發(fā)明還提供一種定量檢測汞-纖維蛋白原螯合物的方法，以已知含量的上述的 汞-纖維蛋白原螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián) 免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純汞-纖維蛋 白原螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純汞-纖維蛋白原螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純 汞-纖維蛋白原螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜 或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。在本發(fā)明中，用檢測汞-纖維蛋白原螯合物的方法可以 列出的有以下幾種，但并不限于以下幾種。
[0094] 其中，上述定量檢測汞-纖維蛋白原螯合物的方法中采用的試劑如下：
[0095]方法一：酶聯(lián)免疫法(ELISA法）檢測汞-纖維蛋白原螯合物，按照如下步驟檢測：
[0096] 1)將能夠捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)，如抗纖維蛋白原抗體（抗FGAb)包被于固相載 體上：用稀釋緩沖液將抗FGAb稀釋至1000-8000倍，加入ELISA板微孔中，4°C過夜16-18 小時，或37°C水浴1-3小時，儲存冰箱；
[0097] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，1000 rmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀；
[0098] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入以1% -5% 牛血清白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗 滌，洗滌完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小時；
[0099] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的汞-纖維蛋 白原螯合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至20-80倍，加入微孔中，37°C作用 1-2小時；
[0100] 5)加入可以捕獲汞的物質(zhì)，并且溫育：移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗 滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋至50000-4000000倍的抗HgAb，37°C作用1-2小時，使抗 HgAb與纖維蛋白原上的金屬汞反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物；
[0101] 6)酶結(jié)合物溫育：移去抗汞抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)抗體，使稀釋的酶標(biāo)抗體的濃度為2yg/mL，37°C作用1-2小時，使其 與酶標(biāo)抗體反應(yīng)；
[0102] 7)底物溫育：移去酶標(biāo)抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入底物， 37°C避光作用30分鐘；
[0103] 8)終止反應(yīng)：將終止液滴加至每一微孔；
[0104] 9)取波長405nm，加完終止液后，將ELISA板置于酶標(biāo)儀上檢測，分別讀取待檢樣 品和標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，通過與標(biāo)準(zhǔn)品組比較，求得待檢樣品的含量（也可不使用酶標(biāo)儀，直接 通過顯色情況進行定性檢測）。
[0105] 該方法利用ELISA原理，可以將全血中的特異性纖維蛋白原提取出來，提取出來 的纖維蛋白原上部分螯合有重金屬汞，而這部分纖維蛋白原上的汞被抗汞抗體所捕獲，之 后可以再被辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體所捕獲（該抗體不識別包被蛋 白），捕獲上的抗體在顯色劑及終止液的作用下，可以在儀器下讀出OD值，而不含有螯合金 屬汞的纖維蛋白原，則不會被抗汞的特異性抗體所捕獲，也不會與辣根過氧化物酶、堿性磷 酸酶等酶標(biāo)記的抗體所捕獲，而所用試劑中也不含有金屬汞（陰性對照組結(jié)果為陰性），因 而當(dāng)所讀取的OD值結(jié)果顯示為陽性時，即可證明檢測出纖維蛋白原上螯合的金屬汞。
[0106] 方法二：酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法(ELISA法+AAS法）檢測汞-纖維蛋白 原螯合物按照如下步驟檢測：
[0107] 1)將能夠捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)，如抗纖維蛋白原抗體（抗FGAb)包被于固相載 體上：用稀釋緩沖液將抗FGAb稀釋至1000-8000倍，加入ELISA板微孔中，4°C過夜16-18 小時，或37°C水浴1-3小時，儲存冰箱；