一種需氧菌或兼性需氧菌的簡(jiǎn)易批量培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體設(shè)及一種需氧菌或兼性需氧菌的簡(jiǎn)易批量培養(yǎng) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)酵是指人們借助微生物在有氧或無(wú)氧條件下的生命活動(dòng)來(lái)制備微生物菌體本 身、或者直接代謝產(chǎn)物或次級(jí)代謝產(chǎn)物的過(guò)程(邱立友，王明道主編.微生物學(xué)：化學(xué)工 業(yè)出版社，2012 :343)。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，在微生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)π柩蹙蚣嫘孕?氧菌的純培養(yǎng)需求日益增多，目前，需氧菌或兼性需氧菌的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)是一種常見(jiàn)、簡(jiǎn)單、 成熟技術(shù)，如液體、固體培養(yǎng)；試管、平皿、茄形瓶培養(yǎng)等，但大批量生產(chǎn)制備，其工藝難度較 大。在大批量需氧菌或兼性需氧菌的純培養(yǎng)發(fā)酵領(lǐng)域，多采用傳統(tǒng)的發(fā)酵罐液體通氣培養(yǎng) 方法，該方法普遍存在生產(chǎn)環(huán)節(jié)易污染、生產(chǎn)效率較低、菌液濃縮困難、污水排放多及生產(chǎn) 成本高等瓶頸。
[0003]密封箱體多層固體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉、操作方便、不易污染、生 產(chǎn)效率高；該技術(shù)的應(yīng)用可顯著降低培養(yǎng)基的用量，節(jié)約產(chǎn)品濃縮成本，降低能耗，減少污 水排放。與傳統(tǒng)發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)方法相比，其培養(yǎng)效率可提高50倍W上，細(xì)菌濃度可 高達(dá)1500 -2000億個(gè)/ml,降低生產(chǎn)成本50%W上。
[0004]經(jīng)百度捜索引擎、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)等捜索"固體平面發(fā)酵"、"固體平面培 養(yǎng)"、"多層方盤(pán)發(fā)酵培養(yǎng)"等詞匯，均未查閱到相同或相近的內(nèi)容?，F(xiàn)行的微生物固體發(fā)酵 培養(yǎng)，是在本領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)技術(shù)、方法，其工藝特征在于混菌發(fā)酵培養(yǎng)，即微生物與 固體培養(yǎng)基顆粒混合在一起。本專(zhuān)利技術(shù)提供的密封箱體多層固體培養(yǎng)方法，工藝特征是 濃縮純培養(yǎng)，即單一細(xì)菌的純化培養(yǎng)。細(xì)菌的批量純化培養(yǎng)在許多生物技術(shù)領(lǐng)域如菌種生 產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)、微生態(tài)制劑和生物酶制劑生產(chǎn)等都有著廣泛的技術(shù)需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)在需氧菌或兼性需氧菌的批量生產(chǎn)制備過(guò)程中普遍存在 生產(chǎn)效率低、菌液濃縮困難、污水排放多或生產(chǎn)成本高等瓶頸問(wèn)題，提供一種需氧菌或兼性 需氧菌的簡(jiǎn)易批量培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉、操作方便、不易污染、生產(chǎn)效 率高，與傳統(tǒng)發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)方法相比，其培養(yǎng)效率可提高50倍W上，細(xì)菌濃度可高 達(dá)1500~2000億個(gè)/ml,降低生產(chǎn)成本50%W上。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種需氧菌或兼性需氧菌的簡(jiǎn)易批量培養(yǎng)方法，采用密封箱體多層方盤(pán)固體平面發(fā) 酵裝置培養(yǎng)；所述的密封箱體和方盤(pán)是W不易變形的耐熱薄板材質(zhì)制作，方盤(pán)的數(shù)量為 10~20個(gè)，密封箱體的大小W僅能容納指定數(shù)量層疊放置的方盤(pán)為準(zhǔn)，密封蓋的對(duì)角處分別 設(shè)置2個(gè)直徑為22mm的接種孔，接種孔用硅膠塞密封；所述密封箱體開(kāi)口處設(shè)有封閉開(kāi)口 的密封蓋，所述密封蓋與箱體開(kāi)口邊緣之間設(shè)有密封膠墊，所述密封蓋、密封膠墊及箱體經(jīng) 貫穿=者的鎖閉螺絲固定連接；鎖閉螺絲設(shè)置于密封蓋四角。
[0007] 所述的不易變形的耐熱薄板材質(zhì)是不誘鋼。
[0008] 每個(gè)方盤(pán)的尺寸根據(jù)生產(chǎn)需求進(jìn)行設(shè)定，如根據(jù)生產(chǎn)需求設(shè)置為：長(zhǎng)45cm~60cm; 寬 30cm~45cm;高 1. 5cm~2. 5cm。
[0009] 所述的需氧菌或兼性需氧菌的簡(jiǎn)易批量培養(yǎng)方法，包括W下步驟：1)通過(guò)密封蓋 上預(yù)留的接種孔，注入按方盤(pán)內(nèi)表面積計(jì)算能形成厚度為3mm~5mm凝膠的瓊脂培養(yǎng)基混懸 液，用硅膠塞密封接種孔，置高溫滅菌設(shè)備中常規(guī)滅菌，待箱體溫度降至50°C~60°C，震蕩 箱體混勻培養(yǎng)基，W方盤(pán)位置為基準(zhǔn)豎立箱體，靜置片刻使瓊膠從縫隙中流入方盤(pán)，待瓊膠 液面平衡穩(wěn)定，然后快速水平放置箱體并使方盤(pán)開(kāi)口朝上，使融化的瓊脂均勻分布于每個(gè) 方盤(pán)中； 2) 待瓊脂降溫凝固，按箱體容積的P/c^2%接種液體菌種，接種采取無(wú)菌術(shù)式，借助超凈 工作臺(tái)或火焰封閉將菌種注入或滴入接種孔中，菌種濃度保持5億個(gè)/mlW上，接種后W方 盤(pán)位置為基準(zhǔn)豎立箱體，靜置片刻使菌液從縫隙中流入方盤(pán)，待菌種液面平衡穩(wěn)定，然后快 速水平放置箱體并使方盤(pán)開(kāi)口朝上，輕輕傾斜、往返震蕩箱體，使菌種充分涂布于瓊脂培養(yǎng) 基表面，置適溫條件下培養(yǎng)24h~72h形成菌苔； 3) 培養(yǎng)物收獲時(shí)按箱體容積的15°/c^20%注入沖洗液，震蕩箱體充分洗涂菌苔后傾斜箱 體，通過(guò)接種孔導(dǎo)出洗涂液即獲得濃縮純培養(yǎng)菌液。
[0010] 所述的需氧菌或兼性需氧菌的簡(jiǎn)易批量培養(yǎng)方法，細(xì)菌在多層方盤(pán)固體培養(yǎng)基上 發(fā)酵培養(yǎng)，義用一次性注入培養(yǎng)基、一次性滅菌、一次性形成多層培養(yǎng)表面、一次性接種、一 次性洗涂收獲。
[0011] 為防止產(chǎn)品污染，通過(guò)無(wú)菌操作采用注射針頭、膠管連接和過(guò)濾空氣箱體內(nèi)增壓 的方法，將濃縮菌液導(dǎo)入容器中，獲得無(wú)污染的濃縮純培養(yǎng)菌液。
[0012] 箱體中殘留的培養(yǎng)基，通過(guò)加熱或高溫滅菌后，在培養(yǎng)基降溫凝固前通過(guò)接種孔 倒出，注水沖洗，將接種孔倒置、淋干備用。
[0013] 本發(fā)明是將實(shí)驗(yàn)室中細(xì)菌的瓊脂平板培養(yǎng)方法進(jìn)行有效放大。在實(shí)驗(yàn)室常用的平 皿或茄形瓶瓊脂平板培養(yǎng)細(xì)菌的方法，因其有效培養(yǎng)面積較小，僅應(yīng)用于小批量細(xì)菌培養(yǎng)， 不適用于細(xì)菌的大量生產(chǎn)制備。1個(gè)密封箱體多層方盤(pán)的有效培養(yǎng)面積約為30000cm2,相 當(dāng)于200個(gè)規(guī)格為500ml茄形瓶的培養(yǎng)面積或468個(gè)直徑為9cm平皿的培養(yǎng)面積。密封 箱體多層方盤(pán)培養(yǎng)技術(shù)在大批量需氧菌或兼性需氧菌生產(chǎn)制備中具有顯著的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉、操作方便、不易污染、生產(chǎn) 效率高，與傳統(tǒng)發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)方法相比，其培養(yǎng)效率可提高50倍W上，細(xì)菌濃度可 高達(dá)1500~2000億個(gè)/ml,降低生產(chǎn)成本50%W上；解決了在需氧菌或兼性需氧菌的批量生 產(chǎn)制備過(guò)程中普遍存在生產(chǎn)效率低、菌液濃縮困難、污水排放多或生產(chǎn)成本高等瓶頸問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為方盤(pán)的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為密封培養(yǎng)箱部分分解結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為密封培養(yǎng)箱整體結(jié)構(gòu)分解結(jié)構(gòu)示意圖； 圖中，10-方盤(pán)，20-箱體，30-密封膠墊，40-密封蓋，410-鎖閉螺絲，50-接種孔。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí) 施例。
[0017] 福建某動(dòng)物微生態(tài)制劑廠，曾應(yīng)用液體發(fā)酵罐通氣發(fā)酵方法生產(chǎn)大腸埃希氏菌 C600,生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，離屯、濃縮過(guò)程中的人工勞動(dòng)繁重，易受雜菌污染，生產(chǎn)效率低下。 也曾改用茄形瓶營(yíng)養(yǎng)瓊脂平面培養(yǎng)，顯著降低了原材料消耗，因其有效培養(yǎng)面積較小，人工 勞動(dòng)繁重，操作環(huán)節(jié)繁瑣、污染機(jī)率高，生產(chǎn)效率受到限制。應(yīng)用本發(fā)明的密封箱體多層方 盤(pán)固體平面發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，設(shè)備簡(jiǎn)單，投入少，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)化，產(chǎn)品污染機(jī)會(huì)減少，降低了生 產(chǎn)成本，減少了污水排放，生產(chǎn)效率顯著提高，連續(xù)生產(chǎn)液體微生態(tài)制劑成品200余噸，取 得了良好的效益。
[0018] 現(xiàn)W生產(chǎn)10L濃度為1500億個(gè)/ml的大腸埃希氏菌（C600)濃縮菌液為例，對(duì)上 述=種培養(yǎng)方法進(jìn)行比較如下： 實(shí)施例1液體發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)發(fā)酵1)設(shè)備 500L發(fā)酵罐；超凈工作臺(tái)（1400X690X520mm);大容量冷凍離屯、機(jī)（Dk4000B，500mlX6)。
[001引。培養(yǎng)基制備 普通肉湯培養(yǎng)基：蛋白腺5kg、牛肉膏1.5kg、氯化鋼2. 5kg、蒸饋水500L(牛肉膏、 蛋白腺為北京奧博星生物公司生產(chǎn))。
[0020] 混勻培養(yǎng)基后，用10%氨氧化鋼調(diào)節(jié)至抑7. 4,發(fā)酵罐W121°C高壓滅菌15min,冷 卻備用（氯化鋼為市售分析純?cè)噭?。
[0021] 3)接種培養(yǎng) 通過(guò)無(wú)菌術(shù)式接入大腸埃希氏菌C600菌種100ml，菌種濃度為5億個(gè)/ml，發(fā)酵罐底 部通入無(wú)菌超濾空氣，打開(kāi)發(fā)酵罐頂部的無(wú)菌超濾排氣孔，37 °C通氣培養(yǎng)36h，細(xì)菌濃度 達(dá)到30億個(gè)/ml。
[002引 4)菌液濃縮 細(xì)菌培養(yǎng)液的分裝在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，將培養(yǎng)菌液分別、多次導(dǎo)出至塑料離屯、瓶中，離屯、機(jī)每次離屯、容量為3000ml(500mix6)，密封離屯、瓶后，分別置于離屯、杯中、對(duì)角離屯、 杯平衡。4000巧m離屯、沉淀10min棄上清，取60ml滅菌生理鹽水依次洗涂6個(gè)離屯、瓶中 的沉淀物，獲得約60ml濃度為1500億個(gè)/ml的濃縮菌液。500L發(fā)酵培養(yǎng)菌液，共累計(jì) 離屯、167次，收集洗涂液，獲得約10L濃度為1500億個(gè)/ml的濃縮菌液。
[002引W主要設(shè)備投資、生產(chǎn)成本 設(shè)備：10.2萬(wàn)元(發(fā)酵罐4.8萬(wàn)元；超凈工作臺(tái)1.2萬(wàn)元；大容量冷凍離 屯、機(jī)4.2萬(wàn)）。
[0024]培養(yǎng)基：1480元(蛋白腺5kgX200元；牛肉膏1. 5kgX300元；氯化鋼 2. 5kgX12 元)。
[00巧]水電費(fèi)：591元(滅菌15KVX3hXl元；培養(yǎng)1KVX36/2hXl元； 離屯、1KVX167/6hX1 元；蒸饋水 500LX1 元)。
[0026] 人員工資：800元（2人X2dX200元)。
[0027] 6)廢物排放 廢棄培養(yǎng)基500L;器具洗刷用水200L。
[0028] 實(shí)施例2茄形瓶營(yíng)養(yǎng)瓊脂平面培養(yǎng) 1) 設(shè)備器材 邸式矩形壓力蒸汽滅菌器(規(guī)格：30L1018X500X600mm);恒溫培養(yǎng)箱（規(guī)格： 610X530X1360mm);超凈工作臺(tái)（規(guī)格：1400X690X520mm);大容量振蕩器；茄形瓶(規(guī) 格：500ml); 2) 培養(yǎng)基制備 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白腺0. 1kg;牛肉膏0. 03kg;氯化鋼0. 05kg;瓊脂0. 15kg;蒸 饋水10L。
[0029] 混勻培養(yǎng)基，用10%氨氧化鋼調(diào)節(jié)至抑7. 4,分裝至200個(gè)茄形瓶中，每瓶50ml, 用硅膠塞密封瓶口，置121 °C高壓滅菌15min,待溫度降至50°C~60°C，震蕩茄形瓶混勻培 養(yǎng)基，水平放置，待瓊脂降溫凝固，形成厚度為3mm~5mm營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝膠備用。
[0030] 3)接種培養(yǎng) 借助超凈工作臺(tái)，通過(guò)無(wú)菌術(shù)式，每個(gè)茄形瓶接入大腸埃希氏菌C600菌種3ml，菌種 濃度為5億個(gè)/ml,硅膠塞密封瓶口。傾斜、搖動(dòng)茄形瓶，使菌種充分涂布于瓊脂培養(yǎng)基表 面，置37 °C培養(yǎng)36h，待菌種生長(zhǎng)形成菌苔。
[0031] 4)菌液收集 通過(guò)無(wú)菌術(shù)式每個(gè)茄形瓶注入滅菌生