施氏鱘種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及魚類種質(zhì)的鑒定，具體涉及一種施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002]鋳形目魚類是地球現(xiàn)存最古老的魚類之一，有“活化石”之稱。施氏鋳QAcipenserdabryanus)屬鋳形目、鋳科、鋳屬，俗名七粒浮子等，主要分布于黑龍江水系，自下游至上游額爾古納河及石勒喀河等；多數(shù)分布于黑龍江中游和松花江下游，烏蘇里江較少。由于過度捕撈和水體污染等原因，施氏鋳的資源量已經(jīng)急劇減少。施氏鋳2010年被世界自然與資源保護聯(lián)盟(Internat1nal Un1n for Conservat1n of Nature and NaturalResources簡稱IUCN)紅色名錄列為極度顏危(Critically Endangered, CR)物種，具有很高的經(jīng)濟價值和科研價值。
[0003]目前對于鋳形目魚類的鑒定主要采用形態(tài)學和分子生物學等方法，由于形態(tài)學不適用于魚子醬等鋳魚產(chǎn)品的鑒定，通常采用線粒體上的分子標記鑒定鋳魚及其產(chǎn)品。如 Boscari 等(Boscari, E., et al., Species and hybrid identificat1n ofsturgeon caviar: a new molecular approach to detect illegal trade.Molecularecology resources, 14(3): 489-498.May 2014 DO1: 10.1111/1755-0998.12203 ISSN1755-098X)采用線粒體D-1oop和S7對施氏鋳進行了鑒定，對施氏鋳的鑒定準確性不高，操作繁瑣。因此，亟待開發(fā)出能夠簡便快速、準確檢測施氏鋳與其他鋳魚的分子鑒定技術，用于放流等種質(zhì)鑒定，監(jiān)管施氏鋳產(chǎn)品等。
[0004]中國專利申請?zhí)?00510010346.0，名稱為“一種鑒定史氏鋳、達氏鰉的技術”的發(fā)明專利，它是在施氏鋳、達氏鰉及其產(chǎn)品DNA檢測中使用具有種屬特異性的DNA分子標記AHN, AHN引物大小為10bp，堿基序列為cacccggatg。用此引物對施氏鋳、達氏鐘及其產(chǎn)品DNA進行PCR檢測，施氏鋳可獲得200bp電泳帶，達氏鰉則無此帶，達到對兩種魚及其產(chǎn)品進行鑒定、標識的目的。該專利方法僅能在一定程度上鑒定出施氏鋳，區(qū)分施氏鋳與達烏爾鰉，適用范圍窄。因此，亟待開發(fā)出能夠簡便快速、準確檢測施氏鋳與其他鋳魚的分子鑒定技術，用于放流等種質(zhì)鑒定和市場監(jiān)管等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了鑒定施氏鋳及其產(chǎn)品，從分子生物學層面上將形態(tài)上不易區(qū)分的施氏鋳或其產(chǎn)品進行鑒定，提供了一種施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒及其使用方法。本發(fā)明在鋳科魚類中篩選核基因片段作為分子標記，應用核基因片段SNP位點，成功鑒定了施氏鋳，同樣適用于施氏鋳產(chǎn)品的鑒定。
[0006]SNP (single nucleotide polymorphism，SNP)是單個核酸差異的分子標記技術，在物種鑒定領域，方法是依據(jù)同一個目的基因序列在近緣物種間的單個堿基的差異，進而用于研究種群遺傳變異和物種鑒定。
[0007]fzd8是卷曲蛋白基因片段，利用fzd8上含有的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，用于施氏鋳的種質(zhì)鑒定，具有實驗準確快捷，操作簡便，適用范圍廣等優(yōu)點。
[0008]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術方案:
一方面，本發(fā)明涉及施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒，包括fzd8基因片段的特異性引物。進一步地，所述試劑盒還包含PCR試劑；優(yōu)選地，所述PCR試劑為:2.5 μ L含Mg2+的Taq酶 10 X buffer ； 2.5 mM dNTPs I yL ；25 pM上游引物 0.5 μ L ；25 pM 下游引物 0.5yL ； 2.5 U μ L 1 Taq DNA 聚合酶 0.2 yL ；19.8 μ L 超純水。
[0009]使用時加入0.5 μ L待檢測樣本的DNA (約50 ng)。
[0010]另一方面，本發(fā)明涉及所述施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒在鑒定施氏鋳或其產(chǎn)品中的應用；優(yōu)選地，所述應用是將施氏鋳或其產(chǎn)品從其他鋳魚或其產(chǎn)品中鑒定出來；優(yōu)選地，所述其他鋳魚為達氏鋳、中華鋳、俄羅斯鋳、西伯利亞鋳、小體鋳及達烏爾鰉的任意一種或者多種。
[0011 ] 所述的施氏鋳廣品或其他鋳魚廣品包括魚子醬.、熏制品、觸頭、皮制品等。
[0012]本發(fā)明所述fzd8基因片段的特異性引物，其核苷酸序列為:
正向引物:5 ’ -TAACCACGACACACAGGATG-3 ’( SEQ ID NO: 8 );
反向引物:5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ (SEQ ID NO:9)。
[0013]利用本發(fā)明所述施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒鑒定施氏鋳種質(zhì)的方法，包括如下步驟:
A、分別取各鋳科魚類樣本，提取基因組DNA;
B、分別以各鋳科魚類的基因組DNA為模板，取施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒進行PCR擴增；
C、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并測序；
D、對鋳科魚類樣本的PCR產(chǎn)物測序結果分別進行序列比對，通過種間序列差異直接鑒定施氏鋳或其產(chǎn)品；
經(jīng)序列比對后，擴增獲得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位為C時，樣本為施氏鋳或其產(chǎn)品；擴增獲得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位為T時，樣本為其他鋳魚或其產(chǎn)品。
[0014]本發(fā)明所述的鋳科魚類包括施氏鋳、達氏鋳、中華鋳、俄羅斯鋳、西伯利亞鋳、小體鋳和達烏爾鰉中的任意一種或者多種。
[0015]所述的施氏鋳廣品或其他鋳魚廣品包括魚子醬.、熏制品、觸頭、皮制品等。
[0016]本發(fā)明所述擴增得到施氏鋳、達氏鋳、中華鋳、俄羅斯鋳、西伯利亞鋳、小體鋳和達烏爾鰉的fzd8基因片段為707bp，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7。
[0017]上述fzd8基因片段經(jīng)序列比對后，確定fzd8基因片段的核苷酸序列的第299位點的堿基是C的樣本來源于施氏鋳，其他鋳科魚類樣本來源的fzd8基因片段的第299位為To即通過鑒定本發(fā)明所述特異性引物擴增出的fzd8基因片段中第299位的堿基是否為C，可鑒定施氏鋳或其產(chǎn)品。
[0018]本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為:
1、本發(fā)明采用核基因DNA序列作為分子標記，相較于線粒體基因，可以更準確快速地將形態(tài)上不易區(qū)分的施氏鋳或其產(chǎn)品鑒定出來。采用fzd8基因片段上SNP位點分析鑒定，具有實驗準確，鑒定可靠快捷，操作簡便等優(yōu)點。
[0019]2、本發(fā)明在鋳科魚類中篩選設計了 fzd8基因片段作為分子標記，應用fzd8基因片段的SNP位點，能把施氏鋳或其產(chǎn)品從達氏鋳、中華鋳、俄羅斯鋳、西伯利亞鋳、小體鋳及達烏爾鰉中鑒定出來。具有適用的待檢測樣本來源更廣，準確性高，實驗快捷，操作簡便，結果準確可靠的優(yōu)點。
[0020]
【具體實施方式】
[0021 ] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容作進一步詳細的描述。
[0022]本發(fā)明使用的主要儀器如下:
PCR 儀:B1-Rad iCycIer 和 MJ100離心機:Eppendorf Centrifuge 5415D
穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:B10-RAD power PAC 300
凝膠成像系統(tǒng):Alphalmage Multimage Light Cabinet
電子天平、培養(yǎng)箱、蒸汽滅菌器、搖床以及一些常用的實驗設備。
[0023]
I %的瓊脂糖凝膠的制備方法:
用天平稱取0.3 g瓊脂糖，倒入30 ml的IXTAE緩沖液中，搖勻后置于微波爐中加熱至完全溶解，取出待稍涼后(防止高溫使EB揮發(fā))，加入EB 2yLo將制膠板(B1-Rad公司)放置于水平位置，然后插入樣品梳子。將之前配制的瓊脂糖凝膠倒入制膠板內(nèi)槽。冷卻半小時待凝膠凝固后取出梳子，將凝膠放入電泳槽(B1-Rad公司)內(nèi)并加入IXTAE電泳緩沖液使其浸沒凝膠。在點樣板上點上1/5體積的點樣緩沖液(溴酚藍)。
[0024]
實施例1
施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定方法，其特征在于:利用施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒PCR擴增后的fzd8基因片段在施氏鋳與達氏鋳之間存在的種間序列差異，經(jīng)序列比對直接鑒定出施氏鋳。
[0025]所述試劑盒中包含的fzd8基因片段的特異性引物，其核苷酸序列為:
正向引物:5 ’ -TAACCACGACACACAGGATG-3 ’( SEQ ID NO: 8 );
反向引物:5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ (SEQ ID NO:9)。
[0026]實施例2
施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定方法，其特征在于:利用施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒PCR擴增后的fzd8基因片段在施氏鋳與達氏鋳和中華鋳之間存在的種間序列差異，經(jīng)序列比對直接鑒定出施氏鋳。
[0027]所述試劑盒中包含的fzd8基因片段的特異性引物，其核苷酸序列為:
正向引物:5 ’ -TAACCACGACACACAGGATG-3 ’( SEQ ID NO: 8 );
反向引物:5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ (SEQ ID NO:9)。
[0028]實施例3 施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定方法，其特征在于:利用施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒PCR擴增后的fzd8基因片段在施氏鋳與達氏鋳、中華鋳和俄羅斯鋳之間存在的種間序列差異，經(jīng)序列比對直接鑒定出施氏鋳產(chǎn)品。
[0029]所述試劑盒中包含的fzd8基因片段的特異性引物，其核苷酸序列為:
正向引物:5 ’ -TAACCACGACACACAGGATG-3 ’( SEQ ID NO: 8 );
反向引物:5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ (SEQ ID NO:9)。
[0030]實施例4
施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定方法，其特征在于:利用施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒PCR擴增后的fzd8基因片段在施氏鋳與達氏鋳、西伯利亞鋳、小體鋳和達烏爾鰉之間存在的種間序列差異，經(jīng)序列比對，得到707bp的fzd8基因序列，依據(jù)基因序列第299位點的堿基是C，鑒定為施氏鋳。
[0031]所述試劑盒中包含的fzd8基因片段的特異性引物，其核苷酸序列為:
正向引物:5 ’ -TAACCACGACACACAGGATG-3 ’( SEQ ID NO: 8 );
反向引物:5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ (SEQ ID NO:9)。
[0032]實施例5
施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定方法，其特征在于:利用施氏鋳種質(zhì)分子標記鑒定試劑盒PCR擴增后的fzd8基因片段在施氏鋳與達烏爾鰉之間存在的種間序列差異，經(jīng)序列比對，得到707bp的fzd8基因序列，依據(jù)基因序列第299位點的堿基是C，鑒定為施氏鋳。
[0033]所述試劑盒中包含的fzd8基因片段的特異性引物，其核苷酸序列為:
正向引物:5 ’ -TAACCACGACACACAGGATG-3