一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒。本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中透明質(zhì)酸檢測過程操作復(fù)雜、以及測定準(zhǔn)確度低的問題，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是：一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，該試劑盒由試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，其特征在于：所述的試劑R1為含有無機(jī)鹽離子、加速劑、表面活性劑、防腐劑的緩沖液；所述的試劑R2為含有標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒、助懸劑、防腐劑、穩(wěn)定劑的緩沖液。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸(HA)是人體基質(zhì)的主要成分之一，為具D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組 成的雙糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的一種粘多糖，分子量為4000萬~8000萬。又稱玻尿酸，糖醛酸，基本結(jié) 構(gòu)是由兩個(gè)雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的大型多糖類。與其它粘多糖不 同，它不含硫。透明質(zhì)酸除見于動物的關(guān)節(jié)液和眼球玻璃體等的分泌液、臍帶、真皮表層等 的結(jié)締組織和Rous肉瘤等某種腫瘤外，它還包括A型、C型鏈球菌屬在內(nèi)的某些細(xì)菌的莢膜 成分。細(xì)菌透明質(zhì)酸不與蛋白質(zhì)結(jié)合，但動物組織中的透明質(zhì)酸或多或少含有一些蛋白質(zhì)， 似乎以蛋白多糖和肽多糖的形態(tài)存在。不過與蛋白質(zhì)部分結(jié)合的方式還不清楚。鏈的長度 以分子量105-106的和較長居多，但每因材料而異，而且使同一材料也決不是均一的，和大 量水結(jié)合具有形成凝膠的性質(zhì)，這些性質(zhì)在生物體內(nèi)對關(guān)節(jié)的潤滑作用，以及皮膚的柔軟 性等與這種物質(zhì)的功能是有聯(lián)系的。另外在結(jié)締組織受傷迅速修復(fù)時(shí)，透明質(zhì)酸的合成會 暫時(shí)升高，是組織再生時(shí)細(xì)胞活動的環(huán)節(jié)之一。從睪丸、皮膚、肝臟等動物組織及蛇毒、蛭、 細(xì)菌、放線菌里也分別發(fā)現(xiàn)可水解和切斷透明質(zhì)酸的氨基葡糖苷或葡糠醛苷鍵的酶。
[0003] HA主要由間質(zhì)細(xì)胞合成，經(jīng)淋巴循環(huán)入血，由肝臟內(nèi)皮細(xì)胞攝取，由特異的透明質(zhì) 酸酶水解，在體液中與蛋白質(zhì)結(jié)合而存在，實(shí)際上屬于糖蛋白的輔基。HA主要存在于結(jié)締組 織、皮膚、關(guān)節(jié)液、軟骨及玻璃體液等處。構(gòu)成該部位的組織基質(zhì)。血清HA是反映肝內(nèi)皮細(xì)胞 功能，反映活動性纖維化，預(yù)測肝硬化的良好指標(biāo)。
[0004] 目前檢測透明質(zhì)酸的方法有酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光。酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù) 雜，耗時(shí)長，且對操作人員有較高的專業(yè)技能要求，且酶聯(lián)免疫法只能定性或者半定量;化 學(xué)發(fā)光法成本高，且所需的儀器價(jià)格昂貴，普遍推廣有一定的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中透明質(zhì)酸檢測過程操作復(fù)雜、以及測定準(zhǔn)確度 低的問題，提供一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，該試 劑盒由試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，其特征在于:所述的試劑R1為含有無機(jī)鹽 離子、加速劑、表面活性劑、防腐劑的緩沖液;所述的試劑R2為含有標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗 體的膠乳顆粒、助懸劑、防腐劑、穩(wěn)定劑的緩沖液。
[0007] 作為優(yōu)選，所述的緩沖液為Tri S緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、甘氨 酸緩沖液中的一種或多種組合而成。所述的無機(jī)鹽離子為氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀中的一種 或多種組合而成。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的加速劑為聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙 烯吡咯烷酮中的一種或幾種。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、EDTA中的一種或多種組 合而成。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的防腐劑為苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種組合而成。 [0011]作為優(yōu)選，所述的表面活性劑為吐溫系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列 中的一種或多種組合而成。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的助懸劑為阿拉伯膠、海藻酸鈉、膠體二氧化硅、甘油中的一種或 多種組合而成。
[0013] 作為優(yōu)選，所述的彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2的成分及相應(yīng)含量如下： 試劑R1: Tris 緩沖液 30~170 mmol/L 氯化鈉 50~250 mmol/L 聚乙二醇-2000 10-30 g/L 吐溫-20 0.5-3.5 mL/L 疊氮鈉 0.5~1.5 g/L 其溶劑為純化水。
[0014] 試劑R2: Tris 緩沖液 20~100 mmol/L 牛血清白蛋白 10~40 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.5~1.5 g/L 標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒1~4 g/L 其溶劑為純化水。
[0015] 作為優(yōu)選，試劑盒的制備和使用包括以下步驟： (1) 試劑R1液的配制： (a) 按照試劑R1的組分含量，將三羥甲基氨基甲烷溶于純化水中，攪拌均勻后，配置成 Tris緩沖液； (b) 按照試劑R1的組分含量，將氯化鈉、聚乙二醇-2000、疊氮鈉、吐溫-20溶于步驟(a) 所制得的緩沖液中，攪拌均勻即制得試劑R1液； (2) 所述的試劑R2的配制如下： (a) 、按照試劑R2的組分含量，將三羥甲基氨基甲烷溶于純化水中，攪拌均勻后，配置成 Tris緩沖液； (b) 、按照試劑R2的組分含量，將牛血清白蛋白、甘油、疊氮鈉溶于純化水中，攪拌均勻 即得分散液； (c) 用步驟(b)制得的分散液溶解標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒，使膠乳顆粒終 濃度為2 g/L，然后超聲分散得到試劑R2; (3) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (4) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的透明質(zhì)酸的濃度。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒的制備方法如下： (a) 將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)1小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為4 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等體 積的含8 mg/mL抗人透明質(zhì)酸抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠乳顆粒最終 濃度為2 g/L; (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4°C封閉過夜;離心去上清，制得標(biāo)記有抗人透明 質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒。
[0017] 本發(fā)明所采用的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的反應(yīng)原理是:樣本中相應(yīng)的透明質(zhì)酸抗原 與標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒發(fā)生特異性結(jié)合，在促凝劑作用下形成不溶性的聚 苯乙烯微球-抗原-聚苯乙烯微球顆粒復(fù)合物乳濁液，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與樣本 中的透明質(zhì)酸抗原濃度成正比關(guān)系，在一定波長下進(jìn)行濁度測定，即可測得樣本中被檢測 透明質(zhì)酸的含量。
式中：ΔΑτ/min以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 ΔAs/min以空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中HA的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明在試劑R1液中添加了加速劑，在試 劑R2中采用標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒，對透明質(zhì)酸的檢測靈敏度更高，檢測準(zhǔn) 確性更好，在助懸劑的作用下，標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒穩(wěn)定懸浮于試劑R2中， 當(dāng)和樣本反應(yīng)時(shí)，在加速劑的作用下，可迅速發(fā)生反應(yīng)，即使在較低量的樣本下，也可以發(fā) 生較為明顯反應(yīng)，因此檢測準(zhǔn)確度高，而且不會產(chǎn)生環(huán)境污染，另外檢測也比較方便。
[0019]
【附圖說明】： 圖1為實(shí)施例1中本試劑盒與化學(xué)發(fā)光法的檢測結(jié)果對比 圖2為實(shí)施例2中本試劑盒與化學(xué)發(fā)光法的檢測結(jié)果對比。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0021] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris 緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 150 mmol/L 聚乙二醇-2000 20 g/L 吐溫-20 2.0 mL/L 疊氮鈉 l.o g/L 其溶劑為純化水。
[0022] 試劑R2: Tris 緩沖液 60 mmol/L 牛血清白蛋白 30 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒2.5g/L 其溶劑為純化水。
[0023] 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: MES緩沖液 100 mmol/L 氯化鉀 150 mmol/L 聚乙二醇-6000 20 g/L 吐溫-20 2.0 mL/L 疊氮鈉 l.〇g/L 其溶劑為純化水。
[0024] 試劑R2: MES緩沖液 70 mmol/L 海藻糖 35.0 g/L 甘油 l〇g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒2.5 g/L 實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、制備標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒： (a) 將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)1小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為4 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等體 積的含8 mg/mL抗人透明質(zhì)酸抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠乳顆粒最終 濃度為2 g/L; (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4°C封閉過夜;離心去上清，制得標(biāo)記有抗人透明 質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒。
[0025] 2、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris 緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 150 mmol/L 聚乙二醇-2000 20 g/L 吐溫-20 2.0 mL/L 疊氮鈉 1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[0026] 試劑R2: Tris 緩沖液 60 mmol/L 牛血清白蛋白 30 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒2.5g/L 其溶劑為純化水。
[0027] 3、全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、檢測步驟 (a) 取200μ1試劑R1與2.5μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入50μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 Δ A = A2-A1； (d) 樣本中透明質(zhì)酸的活性計(jì)算出樣本中的透明質(zhì)酸的 濃度。
[0028] 實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、制備標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒： (a) 將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)1小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為4 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等體 積的含8 mg/mL抗人透明質(zhì)酸抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠乳顆粒最終 濃度為2 g/L; (c)將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4°C封閉過夜;離心去上清，制得標(biāo)記有抗人透明 質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒。
[0029] 2、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: MES緩沖液 100 mmol/L 氯化鉀 150 mmol/L 聚乙二醇-6000 20 g/L 吐溫-20 2.0 mL/L 疊氮鈉 l.〇g/L 其溶劑為純化水。
[0030] 試劑R2: MES緩沖液 70 mmol/L 海藻糖 35.0 g/L 甘油 l〇g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒2.5 g/L 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、 檢測步驟 (a) 取200μ1試劑R1與2.5μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入50μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1; (d) 樣本中透明質(zhì)酸的活性 計(jì)算出樣本中的透明質(zhì)酸的 濃度。
[0031] 參照附圖1，附圖1為用實(shí)施例1所制得的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒多次測定不同樣 本中透明質(zhì)酸的測定結(jié)果，以及在同等條件下與化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果的對比分析。從相關(guān) 性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，本試劑盒與化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果相關(guān)性很好，相關(guān)方程7=1.〇34^_ 0.4714，R2=0.995,從結(jié)果可以看出本試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確性可靠，相關(guān)性良好，可以應(yīng)用于透 明質(zhì)酸的檢測。
[0032]參照附圖2,附圖2為用實(shí)施例2所制得的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒多次測定不 同樣本中透明質(zhì)酸的測定結(jié)果，以及在同等條件下與化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果的對比分析。從 相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，本試劑盒與化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果相關(guān)性很好，相關(guān)方程7=1.03081_ 0.3807，R2=0.9961，從結(jié)果可以看出本試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確性可靠，相關(guān)性良好，可以應(yīng)用于透 明質(zhì)酸的檢測。
[0033]上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，該試劑盒由試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒， 其特征在于:所述的試劑R1為含有無機(jī)鹽離子、加速劑、表面活性劑、防腐劑的緩沖液;所述 的試劑R2為含有標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒、助懸劑、防腐劑、穩(wěn)定劑的緩沖液。2. 如權(quán)利要求1所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于:所述的緩沖液為Tris 緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或多種組合而成，所述 的無機(jī)鹽離子為氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀中的一種或多種組合而成。3. 如權(quán)利要求1所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于:所述的加速劑為聚乙 二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或幾種。4. 如權(quán)利要求1所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于:所述的穩(wěn)定劑為牛血 清白蛋白、蔗糖、海藻糖、EDTA中的一種或多種組合而成。5. 如權(quán)利要求1所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于：所述的防腐劑為苯 酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種組合而成。6. 如權(quán)利要求1所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于:所述的表面活性劑為 吐溫系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列中的一種或多種組合而成。7. 如權(quán)利要求1所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于:所述的助懸劑為阿拉 伯膠、海藻酸鈉、膠體二氧化硅、甘油中的一種或多種組合而成。8. 如權(quán)利要求1所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于:所述的彼此獨(dú)立的試 劑R1和試劑R2的成分及相應(yīng)含量如下： 試劑R1: Tris 緩沖液 30~170 mmol/L 氯化鈉 50~250 mmol/L 聚乙二醇-2000 10-30 g/L 吐溫-20 0.5-3.5 mL/L 疊氮鈉 0.5~1.5 g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris 緩沖液 20~100 mmol/L 牛血清白蛋白 10~40 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.5~1.5 g/L 標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒1~4 g/L 其溶劑為純化水。9. 如權(quán)利要求8所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于:試劑盒的制備和使用 包括以下步驟： (1)試劑R1液的配制： (a) 按照試劑R1的組分含量，將三羥甲基氨基甲烷溶于純化水中，攪拌均勻后，配置成 緩沖液； (b) 按照試劑R1的組分含量，將氯化鈉、聚乙二醇-2000、疊氮鈉、吐溫-20溶于步驟(a) 所制得的緩沖液中，攪拌均勻即制得試劑R1液； (2) 所述的試劑R2的配制如下： (a) 、按照試劑R2的組分含量，將三羥甲基氨基甲烷溶于純化水中，攪拌均勻后，配置成 緩沖液； (b) 、按照試劑R2的組分含量，將牛血清白蛋白、甘油、疊氮鈉溶于純化水中，攪拌均勻 即得分散液； (c) 用步驟(b)制得的分散液溶解標(biāo)記有抗人透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒，使膠乳顆粒終 濃度為2 g/L，然后超聲分散得到試劑R2; (3) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (4) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的透明質(zhì)酸的濃度。10.如權(quán)利要求1所述的一種測定透明質(zhì)酸的試劑盒，其特征在于:所述的標(biāo)記有抗人 透明質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒的制備方法如下： (1) 將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)1小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (2) 將步驟（1)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為4 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等體 積的含8 mg/mL抗人透明質(zhì)酸抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠乳顆粒最終 濃度為2 g/L; (3) 將步驟（2)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4°C封閉過夜;離心去上清，制得標(biāo)記有抗人透明 質(zhì)酸抗體的膠乳顆粒。
【文檔編號】G01N33/536GK106093373SQ201610359607
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司