液中蛋白在分子篩層析過程中蛋白質(zhì)變化情況；紅色曲線為溶液中電導(dǎo)(各種離子濃度)變化情況；黑色箭頭為牛血清白蛋白峰；紅色箭頭為小分子物質(zhì)蛋白峰。
[0025]圖8為實(shí)施例2中牛血清白蛋白通過DEAE-葡聚糖離子交換層析進(jìn)一步精純的效果圖；其中，藍(lán)色曲線為牛血清白蛋白粗純樣品通過離子交換層析蛋白質(zhì)分離情況；紅色曲線為溶液中電導(dǎo)(各種離子濃度)變化情況；黑色箭頭為牛血清白蛋白峰。
[0026]圖9為實(shí)施例2中精純牛血清白蛋白溶液通過G25葡聚糖分子篩層析除鹽和小分子物質(zhì)的效果圖；其中，藍(lán)色曲線為精純后牛血清白蛋白溶液中蛋白質(zhì)分離情況；紅色曲線為溶液中電導(dǎo)(各種離子濃度)變化情況；黑色箭頭為牛血清白蛋白峰；紅色箭頭為小分子物質(zhì)蛋白峰。
[0027]圖10為實(shí)施例2中精純化后的牛血清白蛋白和牛血清進(jìn)行SDS-PAGE電泳效果比對(duì)圖；M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker ；2:精純后的牛血清白蛋白；3:箭頭對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的分子量。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0029]實(shí)施例1
一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法，具體步驟如下:
51.向50mL牛血清中加入50mL生理鹽水混勻，然后加入20g硫酸銨混勻，放入2~8°C冰箱中靜止2小時(shí)，然后8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，收集上清液。
52.向上清液中加入300mL的PBS溶液，混勻后，直接上樣進(jìn)行疏水層析，層析填料為苯基-葡聚糖(GE公司)，使用生理鹽水溶液洗脫填料，收集生理鹽水洗脫峰。疏水層析分離血清白蛋白的效果圖見圖1。
[0030]S3.然后使用分子篩進(jìn)行去除鹽和小分子物質(zhì)，層析填料為G25葡聚糖(GE公司)，收集不含鹽和其它小分子的蛋白峰。通過G25葡聚糖分子篩除鹽和小分子物質(zhì)的效果圖見圖2。
[0031]S4.然后進(jìn)行陰離子交換層析，層析填料為DEAE-葡聚糖(GE公司)，樣品直接上樣后使用0.5M氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫，收集牛血清白蛋白峰。DEAE-葡聚糖離子交換層析進(jìn)一步精純的效果圖見圖3。
[0032]S5.加入β -丙內(nèi)酯，其在溶液中的終濃度為5%。，37°C滅活24小時(shí)；然后進(jìn)行分子篩層析，使用G50葡聚糖(GE公司)層析填料進(jìn)行脫鹽和去除小分子物質(zhì)，此過程使用超純水洗脫，收集牛血清白蛋白。G50葡聚糖分子篩除鹽和小分子物質(zhì)的效果圖見圖4。
[0033]S6.然后使用孔徑為30K的膜包進(jìn)行超濾濃縮，使最終牛血清白蛋白濃度達(dá)到5mg/mL以上；最后使用0.2微米的濾膜進(jìn)行過濾除菌即得高純度牛血清白蛋白；牛血清白蛋白中牛血清白蛋白的純度為99.7%。將精純后的牛血清白蛋白和牛血清進(jìn)行SDS-PAGE電泳效果比對(duì)，結(jié)果見圖5。
[0034]實(shí)施例2
S1.向50mL牛血清中加入10mL生理鹽水混勻，然后加入40g硫酸銨混勻，放入2~8°C冰箱中靜止2小時(shí)，然后8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，收集上清液。
[0035]S2.向上清液中加入300mL生理鹽水，混勻后，直接上樣進(jìn)行疏水層析，層析填料為丁基-葡聚糖(GE公司)，使用0.1M的PBS溶液洗脫填料，收集0.1M的PBS洗脫峰。疏水層析分離血清白蛋白的效果圖見圖6。
[0036]S3.然后使用分子篩進(jìn)行去除鹽和小分子物質(zhì)，層析填料為G50葡聚糖(GE公司)，收集不含鹽和其它小分子的蛋白峰。G50葡聚糖分子篩除鹽和小分子物質(zhì)的效果圖見圖7。
[0037]S4.然后進(jìn)行離子交換層析，層析填料為DEAE-葡聚糖(GE公司)，樣品直接上樣后使用0.5M氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫，收集牛血清白蛋白峰。DEAE-葡聚糖離子交換層析進(jìn)一步精純的效果圖見圖8。
[0038]S5.加入β -丙內(nèi)酯，其在溶液中的終濃度為5%。，37°C滅活24小時(shí)。然后進(jìn)行分子篩層析，使用G25葡聚糖層析填料進(jìn)行脫鹽和去除小分子物質(zhì)，此過程使用超純水洗脫，收集牛血清白蛋白。G25葡聚糖分子篩除鹽和小分子物質(zhì)的效果圖見圖9。
[0039]S6.然后使用孔徑為30K的膜包進(jìn)行超濾濃縮，使用最終牛血清白蛋白濃度達(dá)到5mg/ml以上。最后使用0.2微米的濾膜進(jìn)行過濾除菌即得高純度牛血清白蛋白。牛血清白蛋白中牛血清白蛋白的純度為99.6%。將精純后的牛血清白蛋白和牛血清進(jìn)行SDS-PAGE電泳效果比對(duì)，結(jié)果見圖10。
[0040]實(shí)施例3
一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法，具體步驟如下:
51.向50mL牛血清中加入50mL生理鹽水混勻，然后加入30g硫酸銨混勻，放入2~8°C冰箱中靜止3小時(shí)，然后8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心60分鐘，收集上清液。
52.向上清液中加入250mL的PBS溶液，混勻后，直接上樣進(jìn)行疏水層析，層析填料為苯基-葡聚糖(GE公司)，使用生理鹽水溶液洗脫填料，收集生理鹽水洗脫峰。
[0041]S3.然后使用分子篩進(jìn)行去除鹽和小分子物質(zhì)，層析填料為G25葡聚糖(GE公司)，收集不含鹽和其它小分子的蛋白峰。
[0042]S4.然后進(jìn)行陰離子交換層析，層析填料為DEAE-葡聚糖(GE公司)，樣品直接上樣后使用0.2M氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫，收集牛血清白蛋白峰。
[0043]S5.加入β -丙內(nèi)酯，其在溶液中的終濃度為5%。，37°C滅活24小時(shí)；然后進(jìn)行分子篩層析，使用G50葡聚糖(GE公司)層析填料進(jìn)行脫鹽和去除小分子物質(zhì)，此過程使用超純水洗脫，收集牛血清白蛋白。
[0044]S6.然后使用孔徑為30K的膜包進(jìn)行超濾濃縮，使最終牛血清白蛋白濃度達(dá)到5mg/mL以上；最后使用0.2微米的濾膜進(jìn)行過濾除菌即得高純度牛血清白蛋白。
[0045]對(duì)比例I
一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法，基本操作同實(shí)施例1，唯一不同的是將S3步驟去掉，最后得到的牛血清白蛋白中牛血清白蛋白的純度為80%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.向牛血清中加入生理鹽水或PBS溶液，將牛血清稀釋；向稀釋后的牛血清中加入適量硫酸銨，2~8°C靜置30min以上，離心收集上清液； 52.向上清液中加入2~3倍體積的PBS溶液，混勻后進(jìn)行疏水層析，使用PBS溶液洗脫，收集洗脫液； 53.將洗脫液進(jìn)行分子篩層析，收集不含鹽和其它小分子的蛋白峰；所述層析填料為G10-G75葡聚糖； 54.使用陰離子交換層析進(jìn)一步純化牛血清白蛋白，通過0.1~1.5M濃度氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫，收集精純的牛血清白蛋白； 55.加入非蛋白質(zhì)變性類的滅活劑對(duì)病原微生物進(jìn)行滅活，之后進(jìn)行分子篩層析，使用超純水洗脫收集牛血清白蛋白；所述分子篩層析填料為G25或G50的葡聚糖； 56.使用孔徑為30K的膜包進(jìn)行超濾濃縮，使牛血清白蛋白最終濃度達(dá)到5mg/ml以上；最后使用0.2微米的濾膜進(jìn)行過濾除菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，SI所述生理鹽水或PBS溶液的加入量為牛血清體積的1~3倍。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，SI所述硫酸銨按每100毫升稀釋血清中加入10~30g硫酸銨的量加入。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，SI所述硫酸銨按每100毫升稀釋血清中加入15~25g硫酸銨的量加入。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，SI所述硫酸銨按每100毫升稀釋血清中加入20~25g硫酸銨的量加入。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述疏水層析的填料為苯基-葡聚糖或丁基-葡聚糖。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述陰離子交換層析的填料為DEAE-葡聚糖。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S5所述非蛋白質(zhì)變性類的滅活劑為β-丙內(nèi)酯。
【專利摘要】本發(fā)明屬于蛋白純化技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法。本發(fā)明將稀釋后的牛血清依次經(jīng)過硫酸銨鹽析、分子篩層析、陰離子交換層析、病原微生物進(jìn)行滅活、分子篩層析、超濾濃縮、過濾除菌最終得到高純度牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的純度高于99.5%，而且，牛血清白蛋白中不含有小分子物質(zhì)，例如氯化鈉、硫酸銨、氨基酸等；另外，牛血清白蛋白中不含活病毒。
【IPC分類】C07K1/18, C07K1/20, C07K14/765
【公開號(hào)】CN105017412
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510443132
【發(fā)明人】柏建山, 馮少珍, 戴金, 黃燕瓊, 鄧艷, 何淑華, 陳增榮, 付騰
【申請(qǐng)人】中華人民共和國廣州機(jī)場(chǎng)出入境檢驗(yàn)檢疫局, 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月24日