Fkbp標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及FKBP標記的重組水痘帶狀皰疹病毒，特別是利用細菌人工人色體(bacterialartificialchromosome，BAC)制備FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，還有涉及制備FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒的方法及包含能與水痘-帶狀皰疹病毒基因組進行同源重組的片段。【
背景技術(shù)：
】[0001]水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-zostervirus，VZV)是水痘或帶狀皰疹的病原體，幾乎所有人于成年之前即接觸過該病毒，90%的病例發(fā)生于10歲之前。VZV可引起兩種不同的病癥，在兒童期，初次感染引起水痘，患水痘后機體產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫，終身不再感染。但對長期潛伏于神經(jīng)節(jié)中病毒不能被清除，當潛伏體內(nèi)的病毒受到某些刺激后復發(fā)則導致帶狀皰疹，多見于成年人和老年人。該病毒主要通過空氣飛沫傳播和接觸傳染。[0002]VZV是DNA病毒，含有125kb的堿基，編碼70個開放讀碼框（openreadingframes，ORFs)，其中，44個開放讀碼框是病毒增殖所必需的基因，26個開放讀碼框是病毒增值非必需基因。[0003]基因突變可以改變基因信息，基因突變?yōu)椴《疽呙绲拈_發(fā)提供了極大方便。Kazuhiro等(Cloningofthevaricella-zostervirusgenomeasaninfectiousbacterialartificialchromosomeinEscherichiacoli)將VZVOka株全基因組克隆至BAC載體，病毒基因組可以在大腸桿菌及人胚肺細胞中增殖，BAC可被同事轉(zhuǎn)化到人胚肺細胞中的Cre酶精確切除，產(chǎn)生的VZV重組病毒具有親本Oka同樣的結(jié)構(gòu)與特性；因此，細菌人工人色體的發(fā)展，是病毒突變領(lǐng)域的一大突破，BAC可以克隆大片段病毒基因組。BAC克隆的病毒可以在細菌細胞內(nèi)保持穩(wěn)定并可在細菌體內(nèi)傳播，在細菌細胞可以容易地操作病毒基因組。任何要求的突變都可以在細菌細胞內(nèi)輕松、快速地實現(xiàn)所需的突變，這種突變可以在病毒重組前加以驗證，然后才進行重組病毒；自從發(fā)展了這種構(gòu)建重組病毒新方法，利用這種BAC進行重組突變，使病毒疫苗及其基因組詳細功能的研究取得了很大的進展。[0004]LauraA.Banaszynski等(LauraA.Banaszynski,Ling-chunChen,LystranneA.Maynard-Smith，A.G.LisaOoi，ThomasJ.Wandless)利用一種表達在哺乳動物細胞時高度不穩(wěn)定，并能迅速降解的人FKBP12蛋白的突變體，分析病毒的增殖情況。利用這種方法，構(gòu)建重組病毒，對該病毒的感興趣開放讀碼框（openreadingframe，0RF)進行FKBP變異的不穩(wěn)定域（thedestabilizationdomainofFKBPvariant，daFKBP)進行標記，然后，在該病毒培養(yǎng)過程中，加入一種能夠滲透進入細胞的人工合成配體（syntheticligand)叫做Shieldl，合成配體Shieldl能夠穩(wěn)定不穩(wěn)定域的融合蛋白，使重組病毒傳播。如果培養(yǎng)病毒的細胞中不加Shieldl，ddFKBP標記的融合蛋白快速降解，從而使病毒不能生長。這種標記的ddFKBP為研究病毒基因的作用提供了一種強大的基因工具。[0005]同源重組是基因重組的一種類型，是兩個相同序列的DNA核苷酸之間進行交換。野生型大腸桿菌對誘導外源DNA的同源重組是無效的，因為線性DNA通常被RecB⑶核酸外切酶降解。為了克服這個問題，培育了SWi02菌株，該菌株包含一個溫度敏感的λ噬菌體編碼的一個暫時抑制RecB⑶(gam)的基因，以及兩個基因（exo和beta)在同源重組過程中進行雙鏈的損傷修復。λ噬菌體對溫度是敏感的（由于一個溫度敏感λcl抑制子的表達），當細胞培養(yǎng)溫度從32增加到42°C時，線性DNA的攝取和重組可以在幾分鐘之內(nèi)完成。這樣當細菌細胞在32°C正常生長時，可以有幾千個堿基對進行同源重組。另外改良的溫度敏感的λ噬菌體要求的同源重組：發(fā)生在同源序列相對較窄的一個區(qū)域內(nèi)，因為BAC突變體的建立通常是使用PCR擴增的基因序列，其兩側(cè)應為約40個堿基對與病毒DNABAC序列同源。[0006]FKBP標記的重組水痘帶狀皰疹病毒，其開放閱讀框0RF4和0RF48分別帶有一個高度不穩(wěn)定域標記的人FKBP12蛋白（thedestabilizationdomainofahighlyunstablevariantofthehumanFKBP12protein，ddFKBP)，ddFKBP標記蛋白可以被蛋白酶迅速降解。在該病毒培養(yǎng)過程中，加入一種能夠滲透進入哺乳動物細胞的人工合成配體（Asyntheticligand，shieldl)，該合成配體Shieldl能夠穩(wěn)定不穩(wěn)定域的融合蛋白，使重組病毒傳播。如果培養(yǎng)病毒的細胞中不加Shieldl，ddFKBP標記的融合蛋白快速降解，從而使病毒不能生長。如果培養(yǎng)病毒的細胞中有shieldl存在時，ddFKBP同時標記的0RF4和0RF48突變株能復制；這種標記了ddFKBP的病毒為研制高效價VZV疫苗提供了極大的方便。[0007]已證實接種疫苗是控制水痘及帶狀皰疹的最有效措施，并且兒童接種一次即可獲得終身免疫。目前應用的水痘活疫苗的制備大多采用的是1983年被世界衛(wèi)生組織（WHO)推薦的Oka疫苗株，該疫苗株是日本學者高橋等人開發(fā)的（特公昭53-41202號）。1995年，美國默沙東（Merck，Sharp&Dohme)公司用Oka株生產(chǎn)的水痘-帶狀皰疹減毒活疫苗（V-Oka株）可用于未曾患過水痘的兒童和成人的免疫接種，用以預防水痘的感染和流行。但由于Oka株疫苗自身制備過程中，經(jīng)歷了多次傳代，其基因型有可能發(fā)生改變，并且Oka株本身也可能具有遺傳多樣性。因此，為了保證疫苗的安全性和有效性，把傳代10袋以內(nèi)的病毒作為疫苗。為了研制出優(yōu)于Oka株，并經(jīng)改變基因的水痘-帶狀皰疹減毒疫苗，有必要開發(fā)FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹減毒及其制備方法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明的目的是設計一種用FKBP標記的重組水痘帶狀皰疹病毒，其開放閱讀框0RF4和0RF48分別帶有一個高度不穩(wěn)定域標記的ddFKBP，ddFKBP標記蛋白可以被蛋白酶迅速降解。但shieldl可與ddFKBP結(jié)合，阻止其降解。如果ddFKBP標記病毒在哺乳動物細胞中進行增殖時，培養(yǎng)液有Shieldl存在，病毒能夠進行復制。如果沒有shieldl存在，病毒不能復制；這樣可以有效地控制病毒的復制、安全性和均質(zhì)性。本發(fā)明的課題還在于為了研制一種優(yōu)于Oka株，并經(jīng)過改變的水痘帶狀皰疹病毒疫苗，建立通過誘變生產(chǎn)重組水痘帶狀皰疹病毒的方法。本發(fā)明提供了生產(chǎn)FKBP標記的重組水痘帶狀皰疹病毒的方法，如利用攜帶大腸桿菌人工染色體的Oka株生產(chǎn)FKBP標記的重組水痘帶狀皰疹病毒（即Oka株開放閱讀框0RF4和0RF48分別帶有一個高度不穩(wěn)定域標記的ddFKBP的病毒株）的方法。[0009]本發(fā)明以來自美國羅格斯大學醫(yī)學院朱樺教授實驗室構(gòu)建的IucVZVBAC(Zhangetal.2007)為框架，利用BAC載體研制FKBP標記重組水痘-帶狀皰疹病毒的方法，步驟如下DFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒。2)如1)項中所述的FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，其中所述的必須區(qū)域選自基因4的ORF側(cè)翼區(qū)域及基因48的ORF側(cè)翼區(qū)域。3)如2)項所述的FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，其中所述的水痘-帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。4)如2)項所述的FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，其中所述的開放讀碼框4及48重組水痘-帶狀皰疹病毒基因組在基因4帶有g(shù)alk標記。其引物序列分別為：0RF4galkFw：ggaagatacaggcaactgcaaacacgcaattgtcagatattttgcagccatgCCTGTTGACAATTAATCATCGGCARv：gtcttcacaaatagtagacacgtctgggtcggttggaattgaagcagaggcTCAGCACTGTCCTGCTCCTT5)如4)項所述的FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，其中所述的開放讀碼框4及48重組水痘-帶狀皰疹病毒基因組在基因4序列中ddFKBP標記取代galk標記。0RF4FKBPFw：ggaagatacaggcaactgcaaacacgcaattgtcagatattttgcagccatgATGGGAGTGCAGGTGGAAACCRv：gtcttcacaaatagtagacacgtctgggtcggttggaattgaagcagaggcTTCCGGTTTTAGAAGCTCCAC6)如5)項所述的ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，其中所述的開放讀碼框4及48重組水痘-帶狀皰疹病毒基因組在基因48序列中帶有g(shù)alk標記。0RF48galkFw：gttgttgtgtcacgataattcagaaatacgctcggatcaccctttattatgCCTGTTGACAATTAATCATCGGCARv：tttttggctggctgggggcttatgtcgatcctatccaatcccgatcgtgcTCAGCACTGTCCTGCTCCTT7)如6)項所述的FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，其中所述的開放讀碼框4及48重組水痘-帶狀皰疹病毒基因組在基因48序列中ddFKBP標記當前第1頁1 2