一種病毒樣顆粒的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種病毒樣顆粒的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前常見的疫苗種類有基因工程亞單位疫苗，DNA疫苗，病毒樣顆粒疫苗，減毒活 疫苗。其中，病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs)是含有某種病毒的一個或多個結(jié) 構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒有病毒核酸，不能自主復(fù)制。由于，VLPs和天然病毒形態(tài)相似，很大 程度上保持了蛋白的自然結(jié)構(gòu)，且VLP抗原決定簇及表位與真正的病毒沒有本質(zhì)區(qū)別，因 此可以誘導(dǎo)激發(fā)較強的細胞免疫及體液免疫。并且，由于VLPs不含有病毒基因組核酸，因 此具有相對較高的安全性。目前，VLPs疫苗被認為最具有潛力的疫苗。
[0003] 雖然病毒樣顆粒與活病毒有相似的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，但病毒樣顆粒蛋白的性質(zhì)可能與 活病毒有差異，由于病毒樣顆粒組裝成的空間結(jié)構(gòu)是什么能力使其形成正二十面體結(jié)構(gòu)目 前還不是很清楚，并且其大小與桿狀病毒大小相近。這就給病毒樣顆粒制備過程中的純化 帶來了很多困難。
[0004] 現(xiàn)有研究結(jié)果表明，選用常規(guī)的離子交換層析很難將目的蛋白與雜蛋白分離開 來，對VLPs的純化通常需要經(jīng)過多個步驟。然而，在純化過程中，每增加一個步驟就會對待 純化物造成一定的損失，步驟越多，收率越低。而病毒樣顆粒的產(chǎn)生大多通過昆蟲或酵母表 達系統(tǒng)獲得，如純化方式不當(dāng)，則很難獲得病毒樣顆粒，這無疑限制了病毒樣顆粒疫苗的廣 泛應(yīng)用。
[0005] 羥基磷灰石是由鈣和磷酸鹽成的化合物。陶瓷羥基磷灰石（CHT)中，磷酸離子與 帶正電的蛋白質(zhì)以離子鍵結(jié)合，具有離子交換特性，可由NaCl濃度梯度或磷酸鈉濃度梯 度洗脫，其中的Ca 2+離子與帶負電蛋白質(zhì)的自由羧基以金屬螯合方式結(jié)合，該結(jié)合方式對 NaCl不敏感，可由磷酸、鈉濃度梯度洗脫。羥基磷灰石因陶瓷化工藝不同分為2種類型：1 型和II型?，F(xiàn)有研究結(jié)果認為，陶瓷羥基磷灰石I型對蛋白質(zhì)具有更大的保留，對酸性蛋 白質(zhì)具有更大的動態(tài)載量，因此，陶瓷羥基磷灰石I型主要用于純化大部分蛋白質(zhì)（分子量 一般在IOOkd以下）；陶瓷羥基磷灰石II型由于孔徑較I型大，因而對抗體和部分重組疫 苗等大分子量蛋白質(zhì)的動態(tài)載量更高，而對HSA幾乎無保留，因而陶瓷羥基磷灰石II型更 適合于抗體的純化，同時II型對核酸具有更大的保留，能夠分辯單、雙鏈、超螺旋等各種高 級結(jié)構(gòu)的DNA，因而也適合純化核酸但目前普遍認為，陶瓷羥基磷灰石在純化過程中損失量 過高，因此，尚無將陶瓷羥基磷灰石應(yīng)用于病毒樣顆粒的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種病毒樣顆粒的純化方法。該方 法回收率高、制得的病毒樣顆粒純度大。
[0007] 本發(fā)明提供的病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：將含有病毒樣顆粒的液體 依次經(jīng)蔗糖濃縮、凝膠層析、陶瓷羥基磷灰石層析。
[0008] 由于陶瓷羥基磷灰石具有良好的捕捉力和選擇性，能夠分離其他介質(zhì)不能分離的 各種比較難分離的，性質(zhì)比較接近的生物分子，因此，采用CHT純化能夠大大減少純化步 驟，且所得產(chǎn)物純度較高。盡管如此，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，采用陶瓷羥基磷灰石層析的方法 純化樣品損失量較高，收率較低，因此，陶瓷羥基磷灰石層析通常不適用于純化濃度低、含 量少的物質(zhì)。而病毒樣顆粒通常通過真菌或昆蟲細胞表達產(chǎn)生，其產(chǎn)量通常較低，因此目前 尚未有將陶瓷羥基磷灰石層析用于病毒樣顆粒的純化。本發(fā)明采用CHT層析，將病毒樣顆 粒與CHT特異性吸附，經(jīng)洗脫去除大部分大分子蛋白和雜質(zhì)蛋白。在本發(fā)明的實施例中，陶 瓷羥基磷灰石層析的填料為CHT I型。
[0009] 在本發(fā)明的實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液為PBS緩沖液；其中NaCl的 濃度為 〇· lmol/L ~0· 5mol/L ;pH 值為 7. 0 ~8. 5。
[0010] 在一些實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為0. 2mol/L~ 0· 5mol/L，pH 值為 8. 5〇
[0011] 作為優(yōu)選，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為0. 5mol/L
[0012] 在另一些實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為0. lmol/L~ 0· 5mol/L，pH 值為 8. 0〇
[0013] 作為優(yōu)選，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為0. 4mol/L。
[0014] 在本發(fā)明的實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的洗脫液為PBS緩沖液；其中NaCl的 濃度為lmol/L ;pH值為7. 0~8. 5。
[0015] 在一些實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的洗脫液的pH值為8. 0。
[0016] PBS緩沖液，即磷酸緩沖鹽溶液，其中包括NaCl、KCl、Na2HP0jP KH 2P04。本發(fā)明采 用的PBS緩沖液中，KCl的濃度為2. 7mmol/L，似2即04的濃度為10mmol/L，狃丨04的濃度為 2mmol/L。本發(fā)明實驗表明，固定PBS緩沖液中KC1、Na 2HPOjP KH2PO4的濃度，而調(diào)整其中 的NaCl的濃度，以低NaCl濃度的PBS來平衡層析柱，以高NaCl濃度的PBS來洗脫病毒樣 顆粒能夠達到很好的純化效果，且可以保證收率。實驗表明，采用本發(fā)明提供給的方法，以 陶瓷羥基磷灰石層析的方法純化病毒樣顆粒的收率為86. 31%，而純度可由60 %~70 %提 升至95%。
[0017] 在本發(fā)明的實施例中，凝膠層析的填料為superdex-500。
[0018] 在凝膠層析步驟中，收集外水體積流穿峰。經(jīng)過凝膠層析后，能夠去除一些小分子 蛋白。
[0019] 在本發(fā)明的實施例中，凝膠層析平衡液為PBS緩沖液；其中NaCl的濃度為 0· 2mol/L ~0· 5mol/L ;pH 值為 7. 0 ~8. 5〇
[0020] 在一些實施例中，凝膠層析的平衡液中NaCl的濃度為0· 5mol/L，pH值為8. 5。
[0021] 蔗糖濃縮的主要目的是為了將目的蛋白進行富集，除去脂類和一些雜蛋白。蔗糖 的濃度和離心的速度會對濃縮結(jié)果產(chǎn)生影響。
[0022] 在本發(fā)明的實施例中，蔗糖濃縮具體為：將含有病毒樣顆粒的液體與含有蔗糖的 PBS緩沖液混合，27500rpm離心3~4小時；含有蔗糖的PBS緩沖液中蔗糖的質(zhì)量分數(shù)為 30%〇
[0023] 蔗糖濃縮采用的PBS緩沖液中，KCl的濃度為2. 7mmol/L，似2即04的濃度為 10mmol/L,腿2?0 4的濃度為 2mmol/L，NaCl 的濃度為 137mmol/L〇
[0024] 經(jīng)蔗糖濃縮，樣品濃縮10~50倍。在一些實施例中，經(jīng)蔗糖濃縮樣品濃縮20倍。
[0025] 本發(fā)明提供的純化方法用于純化EV71病毒樣顆粒或CVA16病毒樣顆粒。
[0026] 作為優(yōu)選，純化EV71病毒樣顆粒，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為 0· 2mol/L ~0· 5mol/L，pH 值為 8. 5〇
[0027] 優(yōu)選的，純化EV71病毒樣顆粒，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為 0·5mol/L〇
[0028] 作為優(yōu)選，純化CVA16病毒樣顆粒，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度 為 0· lmol/L ~0· 5mol/L，pH 值為 8. 5〇
[0029] 優(yōu)選的，純化CVA16病毒樣顆粒，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為 0·4mol/L〇
[0030] 在本發(fā)明的實施例中，含有病毒樣顆粒的液體的制備方法為：以含有CVA16或 EV71目的基因的桿狀病毒感染昆蟲細胞，培養(yǎng)至30%~40%的細胞出現(xiàn)病變；離心收獲細 胞，經(jīng)反復(fù)凍融后，離心去除殘渣，經(jīng)過濾制得含有病毒樣顆粒的液體。
[0031] 采用本發(fā)明提供的方法純化CVA16病毒或EV71病毒能夠有效減少純化步驟，經(jīng)純 化后病毒樣顆粒的純度不低于95%，總收率不低于31 %。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種EV71病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：
[0033] 步驟1 :將EV71病毒的Pl片段和3CD片段構(gòu)建入pFastBAcdual載體，與大腸桿 菌DH10BAC轉(zhuǎn)座重組，獲得含有EV71目的基因的表達載體；
[0034] 步驟2 :以含有EV71目的基因的表達載體轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，培養(yǎng)、傳代獲得含有EV71 目的基因的桿狀病毒；
[0035] 步驟3 :以含有EV71目的基因的桿狀病毒感染昆蟲細胞，培養(yǎng)至30%~40%的細 胞出現(xiàn)病變；離心收獲細胞，經(jīng)反復(fù)凍融后，離心去除殘渣，經(jīng)過濾制得含有病毒樣顆粒的 液體；
[0036] 步驟4 :將所述含有病毒樣顆粒的液體依次經(jīng)蔗糖濃縮、凝膠層析、陶瓷羥基磷灰 石層析；制得EV71病毒樣顆粒。
[0037] 本發(fā)明還保護由本發(fā)明提供的制備方法制得的病毒樣顆粒。
[0038] EV71病毒的Pl片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，構(gòu)建入pFastBAcdual載 體采用的酶切位點為Pst I和Hind III。
[0039] EV71病毒的3CD片段如SEQ ID NO: 2所示，構(gòu)建入pFastBAcdual載體采用的酶切 位點為Sph I和Kpn I。
[0040] 在本發(fā)明提供的實施例中，昆蟲細胞為SF9細胞。
[0041] 在一些實施例中，步驟2中培養(yǎng)的時間為3~4天；傳代的次數(shù)為2次。
[0042] 在一些實施例中，步驟3中昆蟲細胞經(jīng)活化，具體方法為：將SF9細胞系培養(yǎng)在IL 搖瓶中，按1 :3比例分種，培養(yǎng)4天接種于WAVE生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。
[0043] 在一些實施例中，步驟3中含有EV71目的基因的桿狀病毒感染昆蟲細胞的接種量 MOI 為 0· 5 ~1。
[0044] 在一些實施例中，步驟3中培養(yǎng)的溫度為27°C，時間為72h~96h。
[0045] 在一些實施例中，步驟3中反復(fù)凍融的次數(shù)為3~4次。
[0046] 在一些實施例中，步驟3中過濾采用0. 45 μ m濾膜。
[0047] 在一些實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的填料為CHT I型。
[0048] 在一些實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液為PBS緩沖液；其中NaCl的濃度 為 0· lmol/L ~0· 5mol/L ;pH 值為 7. 0 ~8. 5〇
[0049] 在一些實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為0. lmol/L~ 0· 5mol/L，pH 值為 8. 5〇
[0050] 作為優(yōu)選，陶瓷羥基磷灰石層析的平衡液中NaCl的濃度為0. 5mol/L
[0051] 在一些實施例中，陶瓷羥基磷灰石層析的洗脫液為PBS緩沖液；其中NaC