一種基于測序法檢測β-酪蛋白基因型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于測序法檢測β -酪蛋白基因型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛奶中的蛋白質(zhì)主要分為酪蛋白和乳清蛋白兩種，酪蛋白在牛奶蛋白中的含量約占80%左右，乳清蛋白約占14%。牛奶蛋白中一般含有四種酪蛋白，α S1-酪蛋白、a S2_酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白，其中β-酪蛋白約占酪蛋白總量的25-35%。
[0003]酪蛋白中含有209個氨基酸，而它至少含有13種不同的氨基酸組成，因此分為A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、1、G。目前大多數(shù)養(yǎng)殖奶牛生產(chǎn)的β _酪蛋白，主要為Al β -酪蛋白和Α2β-酪蛋白兩種類型。在生物體內(nèi)，β-酪蛋白會水解產(chǎn)生一類由4-11個氨基酸組成，起始氨基酸為酪氨酸的多肽——β -酪啡肽，BCM7 (Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-1le)就是從這類多肽中分離出來的一種類似嗎啡的活性肽，它能夠刺激淋巴T細胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由Al-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下產(chǎn)生，這是由于Α2-酪蛋白67位脯氨酸與其相鄰的66位和68位的氨基酸有比較穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，而Al-酪蛋白67位組氨酸與鄰近氨基酸的二級結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能夠?qū)е氯毖孕呐K病、動脈粥樣硬化、I型糖尿病、新生兒猝死癥以及一些精神方面的疾病。
[0004]Al β -酪蛋白的攝入與人類疾病之間的關(guān)系主要基于流行病學研究，Al β -酪蛋白與相關(guān)疾病的危險因素數(shù)據(jù)和死亡數(shù)據(jù)主要來源于世界衛(wèi)生組織。新西蘭流行病學證據(jù)表明Α2牛奶比Al牛奶更有益于人類健康。McLachlan對16個國家30-69歲的男性中Al牛奶與心臟病發(fā)病率進行了調(diào)查，統(tǒng)計結(jié)果表明，缺血性心臟病與Al牛奶的消耗有很強的關(guān)聯(lián)性(s = 0.86)。Ell1tt比較了 10個國家0-14歲兒童I型糖尿病的發(fā)病率，Al β -酪蛋白與其有較大的關(guān)聯(lián)性(s = 0.726)，在冰島，由于當?shù)氐哪膛Ｖ饕獮棣?奶牛，所以該地糖尿病和心臟病的發(fā)病率很低。動物學實驗也表明表明，喂養(yǎng)Al牛奶的兔子與喂養(yǎng)Α2牛奶的兔子相比，膽固醇和血脂水平更高。
[0005]因此，我們需要找到一種能夠有效區(qū)分Al奶牛和Α2奶牛的方法，從而使得養(yǎng)殖場只繁育Α2奶牛，但目前的檢測方法無法檢測出β-酪蛋白不同的基因型，不能保證人們喝的牛奶為Α2牛奶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于目前檢測β_酪蛋白基因型的方法存在的上述不足，本發(fā)明提供一種檢測出β-酪蛋白不同的基因型的基于測序法檢測β-酪蛋白基因型的方法。
[0007]為達到上述目的，本發(fā)明的實施例采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種基于測序法檢測β -酪蛋白基因型的方法，該方法包括以下步驟:
[0009]根據(jù)β_酪蛋白的堿基序列，在6號內(nèi)含子和7號內(nèi)含子上設(shè)計出一對引物，用引物擴增出7號外顯子的片段，所述7號外顯子的片段大小為759bp，所述引物的序列為:
[0010]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCA AAC C3，
[0011]下游引物:5’CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC3，；
[0012]用引物對待檢測的奶?；蚪MDNA進行PCR擴增；
[0013]PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化后，用測序儀進行測序，根據(jù)測序分型結(jié)果進行判斷β-酪蛋白的基因型。
[0014]依照本發(fā)明的一個方面，根據(jù)測序分型結(jié)果進行判斷β_酪蛋白的基因型，具體為:
[0015]如果酪蛋白的67位氨基酸為組氨酸或密碼子為CAT,則β-酪蛋白為Al β-酪蛋白；
[0016]如果β-酪蛋白的67位氨基酸為脯氨酸或密碼子為CCT，則β-酪蛋白為Α2β-酪蛋白；
[0017]如果β-酪蛋白的67位氨基酸為一個雜合子或序列為CC/AT，則β-酪蛋白為Α1Α2β-酪蛋白。
[0018]依照本發(fā)明的一個方面，所述Α2β -酪蛋白的106位氨基酸的密碼子為CAC。
[0019]依照本發(fā)明的一個方面，所述Α2β -酪蛋白的122位氨基酸的密碼子為AGC。
[0020]依照本發(fā)明的一個方面，所述PCR擴增的體系為DNA模板50ng、熱啟動TaqDNA 聚合酶 0.1Μ/μ 1、2.5μΜ dNTP2 μ 1、10 μ M 上下游引物各 I μ l、2XLengend PCRΒμ fferlOy 1、力口 ddH20 至 50 μ I。
[0021]依照本發(fā)明的一個方面，所述PCR擴增的條件:在溫度為92_95°C時預變性5min，然后在溫度為92-95°C時變性15s、在溫度為52-68°C時退火30s、在溫度為68_72°C時延伸30s，進行多個循環(huán)，最后在溫度為68-72°C時延伸7min。
[0022]依照本發(fā)明的一個方面，所述PCR擴增進行35個循環(huán)。
[0023]依照本發(fā)明的一個方面，所述PCR擴增的條件:在溫度為95°C時預變性5min，然后在溫度為95°C時變性15s、在溫度為63°C時退火30s、在溫度為72°C時延伸30s，進行35個循環(huán)，最后在溫度為72°C時延伸7min。。
[0024]本發(fā)明實施的優(yōu)點:本發(fā)明的檢測方法首先根據(jù)β_酪蛋白的堿基序列，在6號內(nèi)含子和7號內(nèi)含子上設(shè)計出一對引物，用引物擴增出7號外顯子的片段，所述7號外顯子的片段大小為759bp，所述引物的序列為:
[0025]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCA AAC C3，
[0026]下游引物:5’CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC3，；
[0027]然后用引物對待檢測的奶?；蚪MDNA進行PCR擴增；最后PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化后，用測序儀進行測序，根據(jù)測序分型結(jié)果進行判斷β -酪蛋白的基因型，本發(fā)明的檢測方法的優(yōu)勢在于可以將β -酪蛋白7號外顯子全部測出，這樣不僅可以檢測出67位氨基酸的突變情況，還能檢測出106位和122位氨基酸的突變情況，從而可以區(qū)分出Α1，Α2，A3，B這四種β_酪蛋白，因此，本發(fā)明人提供的基于測序法檢測β_酪蛋白基因型的方法能檢測出β -酪蛋白不同的基因型，從而保證人們喝的牛奶為Α2牛奶。
【附圖說明】
[0028]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0029]圖1為本發(fā)明所述測序儀對β -酪蛋白進行測序的分型結(jié)果圖；
[0030]圖2為本發(fā)明所述PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0031]圖3為本發(fā)明所述Α2β-酪蛋白的106位測序結(jié)果圖；
[0032]圖4為本發(fā)明所述Α2β-酪蛋白的122位測序結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0033]下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0034]如圖1、圖2所示，一種基于測序法檢測β -酪蛋白基因型的方法，該方法包括以下步驟:
[0035]根據(jù)β_酪蛋白的堿基序列，在6號內(nèi)含子和7號內(nèi)含子上設(shè)計出一對引物，用引物擴增出7號外顯子的片段，所述7號外顯子的片段大小為759bp，所述引物的序列為:
[0036]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCA AAC C3，
[0037]下游引物:5’CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC3，；
[0038]用引物對待檢測的奶?；蚪MDNA進行PCR擴增；
[0039]PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化后，用測序儀進行測序，根據(jù)測序分型結(jié)果進行判斷β-酪蛋白的