基因elovl6檢測豬脂肪沉積的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于豬脂肪沉積檢測領域，尤其是涉及一種基因 EL0VL6檢測豬脂肪沉積 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪組織最重要和最被廣泛了解的功能就是在能量過剩時以甘油三脂的形式儲 存能量而在饑餓狀態(tài)下利用這些能量。脂肪組織曾經(jīng)一直被認為是一個無活性的被動組 織。但是，近三十多年的研究證實，脂肪組織不僅僅是一個能量儲存器官，更是一個重要的 內(nèi)分泌器官，它能分泌許多因子，包括瘦素（1印tin)，腫瘤壞死因子alpha (TNFa)，誘導細 胞死亡的DFF45樣效應因子（CIDEC)和脂肪酸延長因子6 (EL0VL6)等，這些因子統(tǒng)稱脂肪 細胞因子，它們在脂代謝和能量平衡中起著重要的作用。
[0003] ELOVL家族共7個成員，分別命名為ELOVLl~7。EL0VL6是ELOVL家族中的第6個 成員，主要表達于腎上腺，肝、腦、脂肪組織、睪丸、皮膚等合成和儲存脂肪的組織細胞結(jié)構(gòu)， 除在睪丸中的轉(zhuǎn)錄物為2. 5kb外，在其余組織中的轉(zhuǎn)錄物均為6kb。EL0VL6主要促成12C~ 16C飽和與不飽和脂肪酸延伸為18C脂肪酸，EL0VL6是長鏈脂肪酸合成和延伸的限速酶，有 研究表明，EL0VL6作為一種重要的代謝調(diào)控因子，在脂質(zhì)異常代謝，胰島素抵抗中發(fā)揮重要 作用。
[0004] 脂肪對于維持畜禽生命、生長和生產(chǎn)有著不可取代的重要作用。但是，由于近幾十 年來過于注重體重的增長，導致畜禽生產(chǎn)周期日益縮短，而脂肪沉積卻日趨增多。過多的脂 肪沉積不僅會誘發(fā)畜禽疾病，還會降低畜產(chǎn)品的價值。豬是人們重要的肉類來源之一，在生 長過程中及時、動態(tài)的監(jiān)測其機體脂肪的沉積狀況，從而防止脂肪的過度沉積，對于豬的養(yǎng) 殖和生產(chǎn)具有很重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速準確、操作方便且不影響豬正常生長的 基因 EL0VL6檢測豬脂肪沉積的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：基因 EL0VL6檢測豬脂肪沉積的 方法，利用基因 EL0VL6在脂肪組織中的表達水平來檢測豬脂肪沉積。
[0007] 上述基因 EL0VL6檢測豬脂肪沉積的方法，通過定量PCR來檢測基因 EL0VL6在脂 肪組織里mRM的表達量，用于定量PCR基因 EL0VL6特異片段的引物對分別具有以下堿基 序列：
[0008] Forward primer (Pl) ：AGAACACGTAGCGACTCCGAAGAT ；
[0009] Reverse primer(P2) :GACATGCCGACCGCCAAAGATAA〇
[0010] 上述基因 EL0VL6檢測豬脂肪沉積的方法，包括以下步驟：
[0011] ⑴從被檢測的豬組織中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到相應的cDNA樣品；
[0012] (2)用引物對Forward primer和Reverse primer對步驟（1)中的cDNA樣品進行 定量PCR。
[0013] 步驟（1)中的反轉(zhuǎn)錄反應體系和條件為：在20 μ 1反轉(zhuǎn)錄體系中，4 μ I RNA， 2μ1 01ig(dT)，4yl DEPC 水，70°C10min，冰急冷 2min;然后加入：4μ1 Buffer(TaKaRa 5 X Reverse Transcriptase M-MLV Buffer) , I μ I dNTP (Solarbio dNTP Mix),0. 5μ1 RRI(TaKaRa)，0·5μ I M-MLV (TaKaRa Reverse Transcriptase M_MLV)，4 μ I DEPC 水， 42°C lh，9(TC 10min，2(TC 2min ;-2(TC保存。
[0014] 步驟（2)中定量PCR擴增步驟的反應體系和反應條件為：
[0015] 反應體系：在20 μ 1定量PCR反應體系中，含有1 μ I cDNA模板，10 μ SYBR Premix Ex Ta 定量 ΙΙ2Χ (TaKaRa SYBR'f, Premix Ex Ta 定量 ? II (Tli RNaseH Plus)試劑盒）， 0·4μ1 ROX Reference DyeII50X (TaKaRa SYBR，： Premix Ex Ta 定量 ? II(Tli RNaseH Plus)試劑盒），1μΜ的ΙμL引物Ρ1，1μΜ的ΙμL引物P2,6. 6μ1無菌去離子水；
[0016] 反應條件：951€308;951€58,60 1€308,40個循環(huán)；95°(：158,60°(：1111丨11，951€308， 60°C 15s〇
[0017] 針對目前豬的養(yǎng)殖和生產(chǎn)中缺乏有效監(jiān)測其機體脂肪沉積狀況的措施，發(fā)明人研 究發(fā)現(xiàn)，在動物體正常生長階段，EL0VL6促進12C~16C飽和與不飽和脂肪酸延伸為18C脂 肪酸，同時，EL0VL6的表達量上升，以促進動物體的脂肪沉積。EL0VL6的表達水平與體重指 數(shù)和內(nèi)臟脂肪含量正相關(guān)，實驗證明，EL0VL6與脂肪沉積正相關(guān)。據(jù)此，發(fā)明人建立了一種 基因 EL0VL6檢測豬脂肪沉積的方法，利用基因 EL0VL6在脂肪組織中的表達水平來檢測豬 脂肪沉積。該法具有快速準確、操作方便且不影響豬正常生長的特點，適用于在養(yǎng)殖過程中 動態(tài)監(jiān)控豬脂肪沉積情況以便于隨時掌握豬生長狀況。
【附圖說明】
[0018] 圖1是基因 EL0VL6在3月齡、5月齡、8月齡豬脂肪組織中的相對表達量條形圖。
[0019] 圖2是基因 EL0VL6在豬脂肪組織中的相對表達量與豬背膘厚度的相關(guān)性曲線圖。
【具體實施方式】
[0020] 一、研究設計
[0021] 對巴馬香豬進行正常喂食處理，采集3月齡、5月齡、8月齡檢測脂肪酸延長因子 EL0VL6的表達水平，考察EL0VL6的表達量與脂肪沉積率的關(guān)系。
[0022] 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的豬（sus scrofa)的EL0VL6序列（序列登錄號：GI : 545846426 ;參見網(wǎng)址：NCBI 數(shù)據(jù) http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/)，成功設ir| 對特異性 定量引物，可檢測豬的基因組中其相對表達量。豬（sus scrofa)的EL0VL6特異片段，序列 全長為383bp。豬的看家基因甘油醛-3-脫氫酶基因 GAPDH特異片段，序列全長為1341bp。
[0023] 用于定量PCR上述EL0VL6特異片段的引物對，其堿基序列為：
[0024] Forward primer (Pl) ：AGAACACGTAGCGACTCCGAAGAT ；
[0025] Reverse primer(P2) :GACATGCCGACCGCCAAAGATAA〇
[0026] 用于定量PCR豬的看家基因甘油醛-3-脫氫酶GAPDH特異片段的引物，其堿基序 列為：
[0027] Forward primer ：CGTGTCGGTTGTGGATCTGA ；
[0028] Reverse primer :TGACGAAGTGGTCGTTGAGG〇
[0029] 二、研究方法
[0030] I、樣品的制備和處理