一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于肺癌易感基因領(lǐng)域，特別涉及一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌目前是全世界最主要的癌癥死亡原因。2003年世界衛(wèi)生組織（WHO)公布的死 亡率是110萬/年，發(fā)病率是120萬/年。多發(fā)生在40歲以上，發(fā)病年齡高峰在60-79歲 之間。男女患病率為2. 3:1。肺癌的危害因素主要包括吸煙、大氣污染、電離輻射及遺傳因 素等。
[0003] 所謂疾病易感性是指由遺傳決定的易于患某種或某類疾病的傾向性。具有疾病易 感性的人一定具有特定的遺傳特征，簡單地說就是帶有某種疾病的易感基因組型。
[0004] 目前針對肺癌單個易感基因檢測的研究成果已經(jīng)很多，但是不同研究的具體基因 位點(diǎn)與肺癌易感的關(guān)聯(lián)度強(qiáng)弱不一，并且個別基因位點(diǎn)尚不能較為準(zhǔn)確地評價(jià)肺癌易感程 度。
[0005] CN200610116093. X公開了一種通過PARPl基因、CYPlAl基因和XRCCl基因檢測肺 癌易感性的試劑盒，通過三個基因的檢測尚不能全面準(zhǔn)確地評價(jià)肺癌易感程度。
[0006] 因此需要一種能更為全面、準(zhǔn)確評估肺癌易感程度的基因檢測方法，對與肺癌易 感關(guān)聯(lián)度高的一些基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，該試劑盒 可以同時(shí)檢測肺癌易感基因的多個區(qū)域，準(zhǔn)確得出這些區(qū)域的序列信息，根據(jù)各基因位點(diǎn) 突變的綜合信息，結(jié)合易感風(fēng)險(xiǎn)度評估方法計(jì)算出肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，檢測靈敏度高，并能進(jìn)一步 同時(shí)對大量樣品檢測。
[0008] 本發(fā)明的一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，所述試劑盒包括多個肺癌易感基因 的特異性擴(kuò)增引物混合液、測序引物和PCR擴(kuò)增試劑預(yù)混物；其中，特異性擴(kuò)增引物為（方 向?yàn)? ' -3 '端）：
[0017] 所述多個肺癌易感基因的檢測位點(diǎn)分別為：CYPlAlrsl048943 ;CYP2Elrs3813867 和 rs2031920 ;NAT2rsl799929、rsl799930 和 rsl799931 ;ERCC2rsl3181 ;XRCClrs25487 ; GSTPlrsl695。
[0018] 所述測序引物的序列如下（方向?yàn)?' -3'端）：
[0019] CYPlAl ：CTGTCTCCCTCTGGTTACAGGAAG ；
[0020] CYP2E1 ：TGGTTCAGGAGAGGTGCAGTG ；
[0021] NAT2 ：GATGTGGCAGCCTCTAGAAT ；
[0022] ERCC2 ：TCAAACATCCTGTCCCTACTG ；
[0023] XRCCl ：ACCAGCTGTGCCTTTGCCAAC ；
[0024] GSTPl ：AGTGACTGTGTGTTGATCAG ；
[0025] GSTMl與GSTTl基因多態(tài)性為大片段插入/缺失多態(tài)性，若缺失，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 凝膠電泳無條帶。
[0026] 所述PCR擴(kuò)增試劑預(yù)混物包括DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增buffer。
[0027] 所述試劑盒還包括PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑。
[0028] 有益效果
[0029] 本發(fā)明可以同時(shí)檢測肺癌易感基因的多個區(qū)域，準(zhǔn)確得出這些區(qū)域的序列信息， 根據(jù)各基因位點(diǎn)突變的綜合信息，結(jié)合易感風(fēng)險(xiǎn)度評估方法計(jì)算出肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，檢測靈敏 度高，并能進(jìn)一步同時(shí)對大量樣品檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] (1)基因位點(diǎn)信息

[0035] 為了解決準(zhǔn)確評估肺癌易感性的問題，所檢測的基因位點(diǎn)全部選擇自大量臨床樣 本的研究成果，并且樣本來源均為中國漢族人群。研究表明其基因位點(diǎn)為與肺癌易感性高 度相關(guān)。
[0036] (2)特異性擴(kuò)增引物及測序引物
[0038] (3)試劑盒成分
[0039] ①擴(kuò)增引物混合液，每個基因各1管，濃度為2uM。
[0040] ②測序引物1管，濃度為2uM。
[0041] ③PCR擴(kuò)增試劑預(yù)混物1管（包括DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增buffer)
[0042] (4) PCR擴(kuò)增方法
[0043] ①擴(kuò)增體系配置
[0044] 將6uL的擴(kuò)增引物混合液、22uL的PCR擴(kuò)增試劑預(yù)混物及2uL自備的DNA模板添 加至PCR擴(kuò)增管，混合均勻，并短暫離心。
[0045] ② PCR 擴(kuò)增程序：95 cC 3min ;95 cC lmin，63 cC - 58 cC 30sec (0· 5 cC / 循環(huán)）， 72°C 30sec，10 個循環(huán)；95°C lmin，58°C 30sec，72°C 30sec，30 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0046] (5) PCR產(chǎn)物純化
[0047] 本發(fā)明試劑盒提供了 PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后，利用此 回收試劑盒純化并回收PCR擴(kuò)增片段。
[0048] (6) PCR擴(kuò)增片段測序
[0049] 將上述回收到的PCR產(chǎn)物，連同本發(fā)明特異設(shè)計(jì)的測序引物進(jìn)行上機(jī)測序，獲取 基因位點(diǎn)突變信息。
[0050] (7)肺癌易感性的評估
[0051] 根據(jù)各基因位點(diǎn)突變的綜合信息，結(jié)合易感風(fēng)險(xiǎn)度評估方法計(jì)算出肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括多個肺癌易感基 因的特異性擴(kuò)增引物混合液、測序引物和PCR擴(kuò)增試劑預(yù)混物；其中，特異性擴(kuò)增引物為： CYPlAl :AGCTCCACTCACTTGACAC 和 AGGCTGAACCTTAGACCACA ; CYP2E1 :ACATTGTCAGTTCTCACCTCG 和 ACACAATAGAGCTCCACATTGACT ; NAT2 :ATTTTTACATCCCTCCAGTT 和 CTGATAGCACATAAGTTGAT ; ERCC2 :CCCGCTCTGGATTATACGGA 和 TTCATAAGACCTTCTAGCACCA ; XRCCl :AGATCACACCTAACTGGCAT 和 CCGCTCCTCTCAGTAGTCT ; GSTPl :CTCATCCTTCCACGCACATCC 和 CCCCATGACCCGTTACTTGGC ; GSTMl :GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 和 GTTGGGCTCAAATATACGGTGG ; GSTTl :TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC 和 TCACCGGATCATGGCCAGCA。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于：所述多 個肺癌易感基因的檢測位點(diǎn)分別為：CYPlAlrsl048943 ;CYP2Elrs3813867和rs2031920 ; NAT2rsl799929、rsl799930 和 rsl799931 ;ERCC2rsl3181 ;XRCClrs25487 ;GSTPlrsl695。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于：所述測序 引物的序列為： CYPlAl ：CTGTCTCCCTCTGGTTACAGGAAG ； CYP2E1 ：TGGTTCAGGAGAGGTGCAGTG ； NAT2 ：GATGTGGCAGCCTCTAGAAT ； ERCC2 ：TCAAACATCCTGTCCCTACTG ； XRCCl ：ACCAGCTGTGCCTTTGCCAAC ； GSTPl :AGTGACTGTGTGTTGATCAG〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR 擴(kuò)增試劑預(yù)混物包括DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增buffer。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑 盒還包括PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，所述試劑盒包括多個肺癌易感基因的特異性擴(kuò)增引物混合液、測序引物和PCR擴(kuò)增試劑預(yù)混物。本發(fā)明可以同時(shí)檢測肺癌易感基因的多個區(qū)域，準(zhǔn)確得出這些區(qū)域的序列信息，根據(jù)各基因位點(diǎn)突變的綜合信息，結(jié)合易感風(fēng)險(xiǎn)度評估方法計(jì)算出肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，檢測靈敏度高，并能進(jìn)一步同時(shí)對大量樣品檢測。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105018619
【申請?zhí)枴緾N201510445847
【發(fā)明人】張曉晶, 沈挺, 宋毅, 費(fèi)云舟
【申請人】寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月27日