4DNA連接酶、大約1 μ L的純化后的PCR產(chǎn)物（具體體積可根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度調整），剩余的體積用無菌雙蒸水補足。接下來進行轉化實驗，步驟為：從-80°C冰 箱取出感受態(tài)細胞，冰上解凍5min，輕敲混勻后轉移40 μ L感受態(tài)細胞至連接反應管，輕擊 離心管混勾并于冰上放置20min，之后在42°C水浴45_50s，然后迅速轉移至冰上放置2min， 加入950 μ 1的SOC培養(yǎng)液至連接反應管，在37°C振蕩培養(yǎng)（150轉/分）1. 5小時，然后將 每個轉化培養(yǎng)基100 μ L涂到兩個LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，將平板于37°C過夜培養(yǎng) (16-24小時），取出平板后放4°C顯色10h，挑選白斑菌落（陽性克?。?，使用含有氨芐的 LB培養(yǎng)液對其進行擴大培養(yǎng)，提取質粒并送生物公司對插入片段進行測序，使用Nanodrop 2000對測序結果正確的質粒的濃度和純度進行測定，并按照下面公式計算每μ L質粒溶液 中目的基因的拷貝數(shù)：
[0031] 每yL質粒溶液所攜帶的目的基因拷貝數(shù)（拷貝/yL)為：質粒濃度（ng/ μ L) X 6. 02 X IO23/ [(插入片段長度 +3015) X 660 X IO9]。
[0032] 將含有目的基因的質粒按10倍梯度進行系列稀釋，作為ARGs熒光定量PCR實驗 的標準品。
[0033] 制備好了標準品，接下來進行熒光定量PCR實驗。選用引物對正向引物序列如 SEQIDNo. 1 和反向引物序列如 SEQIDNo. 2, tetA-F 5' -CTCACCAGCCTGACCTCGAT-3' /tetA-R 5' -CACGTTGTTATAGAAGCCGCATAG-3' 對 tetA 基因進行擴增。
[0034] 熒光定量PCR擴增反應體系為25 μ L，其中包括2 μ L的模板DNA (I-IOng)，各 0· 5yL的正、反向引物（10μΜ)，12· 5yL的2XSYBR Premix Ex Taq?(大連寶生物公司） 和9. 5 μ L的無菌雙蒸水。
[0035] 熒光定量PCR擴增條件為：95°C預變性lOmin，40個循環(huán)的95°C保持20s (變性）， 57°C保持20s (退火）和72°C保持30s (延伸，該步驟讀取SYBR熒光信號）。
[0036] 采用 TaqMan 探針法以探針 TM1389F(5' -FAM-CTTGTACACACCGCCCGTC-TAMRA-3') 和引物 BACT1369F(5' -CGGTGAATACGTTCYCGG-3' )/PR0K1492R(5' -GGWTACCTTGTTACGACT T-3')對細菌16S rRNA基因進行實時熒光定量PCR分析[參考文獻Suzuki M T，Taylor L T, DeLong E F. Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial populations via 5' -nuclease assays. Applied and Environmental Microbi ology, 2000, 66(11):4605-4614]〇
[0037] 根據(jù)以下公式對ARGs富集水平進行計算：
[0038] ACt = Ct(ARGs)-Ct(16S) (a)
[0039] Δ Δ Ct - A Ct (待測）_ Δ Ct (對照） （b)
[0040] FC = 2[ (AACt)] (c)
[0041] Δ Ct是待測樣品目的基因的Ct值（熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)） 與16SrRNA基因 Ct值的差值，Δ Δ Ct是指待測樣品的目的基因 Δ Ct值與對照樣品的Δ Ct 值的差值，F(xiàn)C值是指待測樣品的目的基因豐度相較于對照樣品的富集倍數(shù)。
[0042] 本研究用相同土壤對87種ARGs進行擴增，通過檢測tetA基因的富集水平與總的 ARGs富集水平（87種抗性基因富集倍數(shù)的加和）的相關性，結果如圖1。
[0043] 由上圖可以看出土壤tetA基因富集倍數(shù)與ARGs總富集倍數(shù)間具有極顯著的正相 關關系（P〈〇. 〇〇1)，因此可根據(jù)土壤中tetA基因的富集水平對土壤抗生素抗性污染水平進 行檢測和評價。
[0044] 驗證例：
[0045] 選取某公園土，并采集三份土壤，采用相同方法對上述87種ARGs和細菌16S rRNA 基因豐度進行了檢測，選取上述研究的國家公園土壤作為對照，根據(jù)公式（a)、（b)和（c)對 這三份土壤的tetA基因的富集倍數(shù)進行了計算，同時根據(jù)公式y(tǒng) = 569. 635+4. 671x(其中 X為tetA富集倍數(shù)，y為ARGs總富集倍數(shù)）對土壤抗生素抗性污染水平進行了預測。土 壤實測的ARGs總富集倍數(shù)分別為2321. 612、651. 486和533. 531，而預測的ARGs總富集倍 數(shù)分別為1042. 197、602. 695和574. 655。通過單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)間沒有顯著 性差異，證明兩組數(shù)據(jù)是相當?shù)?；通過相關分析發(fā)現(xiàn)，兩組數(shù)據(jù)間具有極顯著的正相關關系 (R = I. 00, Ρ〈0· 01) ο
[0046] 上述雖然結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范 圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內。
【主權項】
1. 基因tetA在檢測土壤抗生素抗性污染水平中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其特征是：利用基因tetA的富集倍數(shù)與ARGs總富集倍 數(shù)呈正相關的關系。3. 如權利要求1所述的應用，其特征是：所述基因tetA的富集倍數(shù)與ARGs總富集倍 數(shù)之間的關系：y = 569. 635+4. 671x，其中X為tetA富集倍數(shù)，y為ARGs總富集倍數(shù)。4. 一種tetA基因在檢測土壤抗生素抗性污染水平中的方法，其特征是：具體包括以下 的步驟： (1) 選用正向引物序列如SEQIDNo. 1和反向引物序列如SEQIDNo. 2,對目的抗性基因 tetA進行PCR擴增； (2) 切膠回收純化擴增后的目的抗性基因，將抗性基因連接在T載體上，然后轉化感受 態(tài)大腸桿菌細胞，涂LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板后挑選陽性克隆子，用含有氨芐的LB培養(yǎng) 液進行培養(yǎng)； (3) 檢測從含有氨芐的LB培養(yǎng)菌液中提取的質粒的濃度，換算出單位體積質粒所攜帶 抗性基因的拷貝數(shù)，將含有目的基因的質粒按10倍梯度進行系列稀釋，作為抗性基因標準 品； (4) 提取土壤DNA，土壤DNA和抗性基因標準品同時進行定量PCR擴增tetA基因，根據(jù) tetA基因的富集倍數(shù)和公式y(tǒng) = 569. 635+4. 671x，其中X為tetA富集倍數(shù)，y為ARGs總 富集倍數(shù)，進而得出土壤抗生素抗性污染水平。5. 如權利要求4所述的方法，其特征是：tetA基因的長度是7Ibp。6. 如權利要求4所述的方法，其特征是：所述步驟（1)中的PCR擴增反應體系為25 yL， 其中包括2yL的模板DNA為l-10ng，各0. 5yL的正、反向引物，濃度為10yM，12. 5yL的 2 X Premix Ex Taq?和9. 5 y L的無菌雙蒸水； PCR擴增條件為：95°C預變性IOmin ;40個循環(huán)的95°C保持20s，60°C保持20s和72°C 保持 3〇8,72°(：保持5!^11。7. 如權利要求4所述的方法，其特征是：所述步驟（2)中的轉化感受態(tài)大腸桿菌細胞 具體步驟為：從-80°C冰箱取出感受態(tài)細胞，冰上解凍5min，輕敲混勻后轉移40 y L感受態(tài) 細胞至連接反應管，輕擊離心管混勻并于冰上放置20min，之后在42°C水浴45-50S，然后迅 速轉移至冰上放置2min，加入950 y L的SOC培養(yǎng)液至連接反應管，在37 °C，150轉/分振蕩 培養(yǎng)1. 5小時，然后將每個轉化培養(yǎng)基100 y L涂到兩個LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，將 平板于37°C過夜培養(yǎng)，取出平板后放4°C顯色10h，挑選白斑菌落。8. 如權利要求4所述的方法，其特征是：所述步驟（3)中，質粒濃度換算成每y L質 粒溶液中目的基因的拷貝數(shù)的公式為：質粒濃度（ng/ y U X6. 02X 1023/[(插入片段長度 +3015) X 660 XlO9]。9. 一種檢測土壤抗生素抗性污染水平的試劑盒，其特征是：包括正向引物序列如 SEQIDNo. 1和反向引物序列如SEQIDNo. 2。10. 如權利要求9所述的試劑盒的使用方法，其特征是：將土壤DNA和抗性基因標準品 同時進行定量PCR擴增tetA基因，根據(jù)tetA基因的富集倍數(shù)和公式y(tǒng) = 569. 635+4. 671x， 進而得出土壤抗生素抗性污染水平。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種tetA基因在檢測土壤抗生素抗性污染水平中的應用與方法。根據(jù)特定抗性基因tetA富集倍數(shù)與ARGs總富集倍數(shù)間具有極顯著的正相關關系(P<0.001)，根據(jù)土壤中這種基因的富集水平對土壤抗生素抗性污染的水平進行檢測和評價，極大地節(jié)約了人力、物力，并能較好地反應土壤抗生素抗性污染水平。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105018637
【申請?zhí)枴緾N201510526038
【發(fā)明人】韓雪梅, 梁玉, 李合蓮, 陳瑩
【申請人】濟南大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月24日