上皮干細胞的液體培養(yǎng)的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年2月25日提交的美國專利申請?zhí)?1/769, 076的優(yōu)先權(quán)，該美 國專利申請W其整體引入作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本文提供在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)上皮干細胞和含有上皮干細胞的組織碎片（tissue fragment)的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 小腸上皮每2至5天更新，使它成為再生性最強的哺乳動物組織之一。已基于 定位和循環(huán)動態(tài)描述了小腸中的兩類干細胞。參見例如Barker等，^^re449,1003 -1007 (2007) ;Sangiorgi,E.&Capecchi,M.R.化tureGenet.40,915 - 920 (2008); Li,L. &Clevers,H.Science327, 542 - 545 (2010)。快循環(huán)干細胞表達包括Lg巧、 Cdl33 (也稱為Proml)和Sox9的標記，且存在于整個腸中。參見Zhu,L.等，化化re 457, 603 - 607 (2009) ;Rmiyama，K.等，化UireGenet. 43, ：34 - 41 (2011)。運些細長細 胞（也稱為隱窩基底柱狀細胞（CBC))3天內(nèi)在隱窩和絨毛內(nèi)繁殖，并散布在支持它們的 帕內(nèi)特細胞間。參見Sato,T.等，化Uire469,415 - 418(2011) ;Cheng，H.化eblond，C. P.，Am.J.Anat. 141,537 - 561(1974)。WBmil或小鼠Ted(mTert)的富集表達為標記 的慢循環(huán)干細胞代表更稀少的細胞群體。參見Sangiorgi,E. &Capecchi,M.R.化化re Genet. 40, 915 - 920 (2008)。運些細胞從腸的近端區(qū)域至遠端區(qū)域形成遞減梯度，使得它們 在十二指腸中比在結(jié)腸中更普遍存在。盡管它們稀少，但表達Bmil的干細胞對隱窩維持至 關(guān)重要。
[0005] 已描述了用于培養(yǎng)包括腸上皮干細胞的原代上皮干細胞的多種培養(yǎng)系 統(tǒng)（Bjerknes和化eng,MethodsEnz;ymol419, 337-83(2006);及Sato等，Nature 459, 262-265(2009))。迄今為止，培養(yǎng)系統(tǒng)倚賴于用固體胞外基質(zhì)來培養(yǎng)原代上皮干細胞。 之前的研究已表明，固體胞外基質(zhì)對維持上皮干細胞的多能性和保持已從結(jié)腸或腸分離的 隱窩的基本隱窩-絨毛生理學(xué)是必要的（參見例如W02010/090513)。已顯示用ECM培養(yǎng) 干細胞增強了干細胞的長期存活和未分化干細胞的持續(xù)存在。之前，在缺乏ECM的情況下， 干細胞培養(yǎng)基不能較長時期培養(yǎng)，且未觀察到未分化干細胞的持續(xù)存在。此外，ECM的存 在允許培養(yǎng)在缺乏ECM的情況下不能培養(yǎng)的S維組織類器官（organoid)。但是，由于該培 養(yǎng)系統(tǒng)的固體性質(zhì)，對可用該培養(yǎng)系統(tǒng)研究的測試和診斷化合物的類型存在大小限制（例 如，大分子不能擴散入固體基質(zhì)）。此外，由于細胞和高級結(jié)構(gòu)包埋在固體基質(zhì)中，分析細胞 和高級結(jié)構(gòu)的容易程度降低（例如，必須從固體基質(zhì)剖出高級結(jié)構(gòu)（例如類器官）進行分 析）。需要更好的上皮干細胞（尤其是腸上皮干細胞）培養(yǎng)系統(tǒng)，該培養(yǎng)系統(tǒng)保持上皮干細 胞的生理學(xué)結(jié)構(gòu)，維持上皮干細胞的多能性，并保持類器官的基本生理學(xué)，同時增加測試和 診斷化合物的類型及分析的容易程度。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本文提供用于液體培養(yǎng)干細胞的方法。具體而言，本文提供用于液體培養(yǎng)（a)上 皮干細胞和/或化）分離的包含上皮干細胞的上皮組織碎片的方法，該方法包括在液體細 胞培養(yǎng)基（liquidcellculture)中解育上皮干細胞和/或分離的組織碎片，該液體細胞 培養(yǎng)基包含用于動物細胞或人細胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向該基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入（i)骨形態(tài)發(fā)生蛋 白度MP)抑制劑、扣）促細胞分裂生長因子、（iii)Wnt激動劑和（iv)至少約4%w/v的胞 外基質(zhì)巧CM)。此外，本文提供用于獲得和/或培養(yǎng)隱窩的方法，該方法包括在液體細胞培 養(yǎng)基中解育上皮干細胞和/或分離的組織碎片，該液體細胞培養(yǎng)基包含用于動物細胞或人 細胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向該基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入（i)骨形態(tài)發(fā)生蛋白度M巧抑制劑、（ii)促細胞 分裂生長因子、（iU)Wnt激動劑和（iv)至少約4%w/v的胞外基質(zhì)巧CM)。
[0008] 在任意方法的一些實施方案中，該BMP抑制劑是頭蛋白、DAN和/或DAN樣蛋白， 包括Cerberus和Gremlin。在一些實施方案中，該BMP抑制劑是頭蛋白。在一些實施方案 中，該BMP抑制劑在該液體細胞培養(yǎng)基中的濃度在約5和約500ng/ml之間（例如約50至 約lOOng/mL)。
[0009] 在任意方法的一些實施方案中，該Wnt激動劑是Wnt、R-spondin(RSPO)、Norrin 和/或GSK抑制劑。在一些實施方案中，該Wnt激動劑是RSPO。在一些實施方案中，該Wnt 激動劑是RSP01。在一些實施方案中，該Wnt激動劑是RSP02。在一些實施方案中，該Wnt 激動劑是RSP03。在一些實施方案中，該Wnt激動劑是RSP04。在一些實施方案中，該Wnt 激動劑在該液體細胞培養(yǎng)基中的濃度在約50化g/mL和約5yg/ml之間（例如約500至約 1500ng/mL)〇
[0010] 在任意方法的一些實施方案中，該促細胞分裂生長因子是上皮生長因子巧GF)、轉(zhuǎn) 化生長因子-a(TGF-a)、堿性成纖維細胞生長因子化FGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子度DNF) 和角質(zhì)形成細胞生長因子（KGF)。在一些實施方案中，該促細胞分裂生長因子是EGF。在一 些實施方案中，該促細胞分裂生長因子在該液體細胞培養(yǎng)基中的濃度在約5和約50化g/ml 之間（例如約5至約50ng/mL)。
[0011] 在任意方法的一些實施方案中，該ECM是低生長因子ECM(g;rowthfactorrecced ECM)。在一些實施方案中，該ECM是基質(zhì)膠。在一些實施方案中，該ECM在該液體細胞培養(yǎng) 基中的濃度在約4%至約10%w/v之間。在任意方法的一些實施方案中，該方法包括懸滴 培養(yǎng)。
[0012] 在任意方法的一些實施方案中，該培養(yǎng)基進一步包含Rock巧ho激酶）抑制劑。
[0013] 在任意方法的一些實施方案中，該培養(yǎng)基進一步包含Notch激動劑。
[0014] 在任意方法的一些實施方案中，該上皮干細胞和/或上皮組織碎片是胃腸干細胞 和/或胃腸組織碎片。在一些實施方案中，該胃腸干細胞和/或胃腸組織碎片是小腸干細 胞和/或小腸組織碎片。
[0015] 本文還提供可通過本文所述的方法獲得的隱窩及該隱窩在藥物發(fā)現(xiàn)篩選、毒性測 定中或在再生醫(yī)學(xué)中的用途。
[0016] 附圖簡述
[0017]圖1A-B. (A)源自小鼠的類器官在隱窩樣結(jié)構(gòu)中顯示膜GFP化胖5陽性 干細胞）和溶菌酶染色（帕內(nèi)特細胞，箭頭）。度）光學(xué)橫截面。 陽01引圖2A-D.在存在度、B-1、D)或缺乏（A、A-1、C)白喉毒素值T)的情況下培養(yǎng)源自Lgr5°?wp小鼠的類器官10天。隱窩樣結(jié)構(gòu)和溶菌酶陽性細胞保持在DT處理的類器官中 度、B-1)。類器官在DT的存在下持續(xù)增殖值）。
[0019] 圖3A-D.在多種濃度的基質(zhì)膠中培養(yǎng)源自Lgr5°?wp小鼠的類器官。
[0020] 發(fā)明詳述 陽〇2U I.定義
[0022] 術(shù)語"多膚"在本文中指天然序列多膚、多膚變體及天然序列多膚和多膚變體（其 在本文中進一步定義）的片段。本文所述的多膚可W是分離自多種來源（如分離自人組織 類型或分離自另一來源）或通過重組方法或合成方法制備的多膚。
[0023] "天然序列多膚"包含與源自自然界的相應(yīng)多膚具有相同的氨基酸序列的多膚。
[0024] "多膚變體"或其變形意指本文定義的多膚，通常為活性多膚，其與本文公開的任 意天然序列多膚序列具有至少約80%氨基酸序列同一性。運類多膚變體包括，例如，其中 在天然氨基酸序列的N-或C-端添加或缺失了一個或多個氨基酸殘基的多膚。通常，多膚 變體將與本文公開的天然序列多膚序列具有至少約80%氨基酸序列同一性，備選地，至少 約 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。通常，變體多膚長度為至少約10個氨基酸，備 選地，長度為至少約 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、 380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、 570、580、590、600個氨基酸，或更長?？蛇x地，與天然多膚序列相比，變體多膚將具有不超過 一個保守氨基酸取代，備選地，與天然多膚序列相比不超過2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守 氨基酸取代。
[00巧]"分離的"指已從其天然環(huán)境的成分分開的多膚、抗體、核酸等。在抗體的一些實施 方案中，將抗體純化至通過例如電泳（例如SDS-PAGE、等電聚焦（IEF)、毛細管電泳）或?qū)?析（例如離子交換或反向冊LC)測定的純度大于95%或99%。用于評估抗體純度的方法 的綜述參見例如Flatman等，J.C虹omatogr.B848:79-87 (2007)。
[00%] 術(shù)語"抗體"在本文中W最廣泛的含義使用，涵蓋多種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單 克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們顯示希 望的抗原結(jié)合活性。
[0027] 就參考多膚序列而言的"百分比（％ )氨基酸序列同一性"定義為在比對序列并在 必要時引入缺口來達到最大百分比序列同一性，而不將任意保守取代視為序列同一性的部 分之后，候選序列中與參考多膚序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比?？?本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)的多種方式來達到W測定百分比氨基酸序列同一性為目的的比對，例如， 使用公開可得的計算機軟件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megali即值NASTAR)軟件。本領(lǐng)域 技術(shù)人員可W確定用于比對序列的適當參數(shù)，包括在所比較的序列的全長內(nèi)達到最大比對 所需的任意算法。但是，為了本文的目的，用序列比較計算機程序ALIGN-2來產(chǎn)生％氨基酸 序列同一性值。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech，Inc.編寫，源代碼已隨用戶文 件提交美國版權(quán)辦公室，WashingtonD.C.，20559,它在美國版權(quán)辦公室注冊在美國版權(quán)注 冊號TX呪 10087 之下。ALIGN-2 程序從Genentech,Inc. ,SouthSanRrancisco,化lifornia 公開可得，或者可W從源代碼編譯。ALIGN-2程序應(yīng)編譯用在UNIX操作系統(tǒng)上，包括數(shù)字UNIXV4.0D。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變動。
[0028] 在利用ALIGN-2來進行氨基酸序列比較的情況下，按W下計算給定氨基酸序列A 與給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性（其可W備選地敘述為，具有或包含與給定氨 基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A):
[0029] 100 乘W分數(shù)X/Y
[0030] 其中X是在該程序的A和B的比對中通過序列比對程序ALIGN-2評分為相