用于治療mps1的組合物和方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于治療MPS1的組合物和方法
[000。 發(fā)明背景
[0002] 粘多糖膽積癥是由缺乏糖胺聚糖（GAG)(也被成為粘多糖）降解中設(shè)及的特異 性溶酶體酶引起的一組遺傳性障礙。部分降解的GAG的累積引起對(duì)細(xì)胞、組織、和器官功 能的干擾。隨著時(shí)間，GAG在細(xì)胞、血液和結(jié)締組織內(nèi)累積，造成越來(lái)越多的細(xì)胞和器官 損傷。最嚴(yán)重的粘多糖膽積癥（MP巧障礙MPSI是由酶aA-艾杜糖巧酸酶（IDUA)的 缺乏引起的。運(yùn)導(dǎo)致S種臨床綜合征，按嚴(yán)重性的順序?yàn)橘R勒氏化urler)、賀勒-施艾氏 化urler-Scheie)和施艾氏（Scheie)綜合征。每一種都是常染色體隱性遺傳，酶缺陷的程 度與臨床表型的嚴(yán)重性直接相關(guān)。
[0003] 已經(jīng)報(bào)道IDUA基因?yàn)樯a(chǎn)稱(chēng)為a 艾杜糖巧酸酶的酶提供指示，運(yùn)種酶對(duì)于分 解稱(chēng)為糖胺聚糖（GAG)的大的糖分子是必要的。具體地，報(bào)道了a艾杜糖巧酸酶從被 稱(chēng)為硫酸化a 艾杜糖醒酸的分子中去除硫酸素（sul化te)，硫酸素存在于被稱(chēng)為硫酸 乙酷肝素和硫酸皮膚素兩種GAG中。a 艾杜糖巧酸酶位于溶酶體中，溶酶體是細(xì)胞內(nèi)消 化和再循環(huán)不同種類(lèi)的分子的隔室。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IDUA基因中的多于100種突變引起I型粘 多糖膽積癥（MPSI)。改變一個(gè)DNA結(jié)構(gòu)單元（核巧酸）的突變是最常見(jiàn)的。引起MPSI 的突變減少或完全消除a艾杜糖巧酸酶的功能。
[0004]關(guān)于臨床綜合征，目前對(duì)賀勒氏綜合征的醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)是造血干細(xì)胞移植化SCT)，如 骨髓移植度MT)或廝帶血移植扣CBT)。要盡早并且在兩歲前進(jìn)行運(yùn)一手術(shù)，從而影響疾病 的軀體和CNS兩個(gè)方面。然而，對(duì)于MPSI的HSCT仍然與大量發(fā)病和20%的死亡率相關(guān)。 如果移植不是選項(xiàng)，則可W開(kāi)始酶替代療法巧RT)，該療法需要為了患者的生命而每周輸注 酶。邸T不影響CNS疾病的進(jìn)展，但部分改善軀體表現(xiàn)。器官巨大癥得到顯著改善，盡管疾 病在骨骼系統(tǒng)、眼和屯、臟方面僅得到部分改善。患者可能需要手術(shù)來(lái)穩(wěn)固臀部和膝蓋并且 來(lái)治療腕管綜合征和手指收縮。屯、臟疾病用藥物治療，盡管最終可能需要手術(shù)。
[0005] 對(duì)于MPSI的ERT提供外源性酶來(lái)攝取到溶酶體中并且增加GAG的分解代謝。盡 管溶酶體酶在內(nèi)部起作用，細(xì)胞表面甘露糖-6-憐酸受體能夠結(jié)合、內(nèi)化、和遞送運(yùn)些酶到 溶酶體。重組IDUA(阿杜拉酶（Aldura巧me貨），拜馬林制藥度ioMarin))被抑A批準(zhǔn)用 于患有賀勒氏和賀勒-施艾氏形式的MPSI的患者和用于患有施艾氏形式的患者，運(yùn)些患 者具有中等到嚴(yán)重的癥狀并且被示為改善了肺功能和行走能力。還觀察到了ERT減少M(fèi)PS I患者的肝臟腫大W及尿液中GAG的水平。然而，因?yàn)殪o脈內(nèi)的酶不容易穿過(guò)進(jìn)入腦部，所 W目前ERT沒(méi)有解決某些MPSI患者經(jīng)歷的神經(jīng)癥狀。
[0006]ERT的并發(fā)癥圍繞對(duì)重組酶的免疫應(yīng)答，其范圍可W從溫和到全面過(guò)敏反應(yīng)W及 終生外周通路并發(fā)癥如局部和全身感染。高達(dá)91%的接受阿杜拉酶的患者發(fā)展出了對(duì)酶 的抗體，盡管并不清楚它對(duì)療效有多大影響。進(jìn)一步地，ERT需要在醫(yī)院環(huán)境下每周靜脈內(nèi) (i.V.)輸注，經(jīng)3-8小時(shí)的時(shí)期給藥，運(yùn)嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，并且高昂的費(fèi)用是衛(wèi) 生保健報(bào)銷(xiāo)系統(tǒng)的主要壓力。
[0007] 鑒于運(yùn)些限制，可W更有效地矯正與MPSI相關(guān)的發(fā)病的治療仍然是未滿足的醫(yī) 療需求。
[000引發(fā)明概述
[0009] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括人a 艾杜糖巧酸酶化IDUA) 基因，該基因具有SEQIDNO: 1核巧酸序列或在人細(xì)胞中編碼功能性人a艾杜糖巧酸 酶的、與SEQIDNO: 1具有至少約95%-致性的序列，其中所述表達(dá)盒進(jìn)一步包括在人細(xì)胞 中指導(dǎo)人a 艾杜糖巧酸酶表達(dá)的調(diào)控序列，所述調(diào)控序列包括肝臟特異性啟動(dòng)子。
[0010] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含該表達(dá)盒的載體。在一個(gè)實(shí)施例中，該表達(dá)盒位 于cis質(zhì)粒上。在另一個(gè)實(shí)施例中，該表達(dá)盒位于祀順.TBG.hIDUA.nRBG上。
[0011] 在還另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了重組腺相關(guān)病毒（rAAV)顆粒，該顆粒具有AAV衣 殼并且具有包裝在其中的左反向末端重復(fù)序列（口時(shí)、在控制其表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的控制下 的人aA-艾杜糖巧酸酶化IDUA)基因、和AAV右口R，其中所述hIDUA基因具有在SEQID NO: 1 (圖1)中示出的序列或編碼功能性人aA-艾杜糖巧酸酶的、與SEQIDNO: 1示出的 序列具有至少約95%-致性的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，該功能性hIDUA基因在肝臟特異性 啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行表達(dá)。運(yùn)種啟動(dòng)子可W是甲狀腺素結(jié)合球蛋白（TBG)啟動(dòng)子。
[0012] 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了重組腺相關(guān)病毒顆粒AAV2/8.TBG.hIDUA.CO。
[0013] 在還另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于治療I型粘多糖膽積癥（MPSI)有用的組合 物，該組合物包括rAAV和藥學(xué)上可接受的載體，該rAAV包括在此所述的表達(dá)盒。
[0014] 在仍另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療I型粘多糖膽積癥的方法，該方法包括 遞送有效量的組合物，該組合物包括藥學(xué)上可接受的載體和如在此所述的rAAV。
[0015] 在還另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療或改善賀勒氏、賀勒-施艾氏和/或施艾 氏綜合征的癥狀的方法。
[0016] 本發(fā)明的還有其他方面和優(yōu)點(diǎn)將從本發(fā)明的詳細(xì)描述中顯而易見(jiàn)。
[0017] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[001 引 圖 1A至 1D提供了在此所述的祀NN.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB質(zhì)粒[SEQIDNO: 3] 的序列，該序列包括功能性人IDUA基因的核酸序列。功能性IDUA的基因位于圖1的位置 1251-3213處，并且還在SEQIDN0:1和2中提供了其編碼的酶序列。進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行注 釋W(xué)標(biāo)識(shí)W下序列：amic/b化增強(qiáng)子、內(nèi)含子1、兔球蛋白polyA、口R、復(fù)制起點(diǎn)。
[001引 圖2提供了祀順.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB的環(huán)狀圖。
[0020] 發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明
[0021] 在此所述的組合物提供了攜帶人IDUA基因的表達(dá)盒，該表達(dá)盒在人類(lèi)受試者中 表達(dá)治療有效量的功能性人aA-艾杜糖巧酸酶。
[0022] 如在此所使用，"治療有效量"指在祀細(xì)胞中遞送和表達(dá)足W改善或治療賀勒氏、 賀勒-施艾氏和/或施艾氏綜合征、和或MPSI癥狀的酶的量的組合物的量。"治療"可W 包括預(yù)防運(yùn)些綜合征（或MPSI)中的一種的癥狀的惡化并可能逆轉(zhuǎn)其癥狀中的一種或多 種。
[0023] 如在此所使用的"功能性人a 艾杜糖巧酸酶"指人a 艾杜糖巧酸酶 的酶，該酶通常在未患有MPS1或相關(guān)綜合征（如賀勒氏、賀勒-施艾氏和/或施艾氏 綜合征）的人中起作用。相反地，引起MPS1或運(yùn)些綜合征中的一種的人aA-艾杜糖 巧酸酶的酶的變體被認(rèn)為是非功能性的。在一個(gè)實(shí)施例中，功能性人a-^艾杜糖巧 酸酶具有布雷默度remer)等人在W下文獻(xiàn)中所描述的野生型人a 艾杜糖巧酸酶 的氨基酸序列：分子遺傳學(xué)與新陳代謝（Mol.Genet.Met油.）104 (3) : 289-294 (2011)，NCBI參考序列NP_000194. 2,重現(xiàn)在SEQIDN0:2化53個(gè)氨基酸）中。然而，此序列的 若干天然發(fā)生的功能多態(tài)性（變體）已被描述并可W涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。參考 SEQIDN0:2,運(yùn)些變體包括在位置110處的N-鍵聯(lián)糖基化[陳（化en)等人，蛋白質(zhì)組 學(xué)研究雜志（JProteomeRes.)，8:651-661(2009)]，在氨基酸位置33處的從H到Q的 改變[SEQIDN0:7,VAR_003350 ;斯科特?服(Scott,服）等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊 (Proc化tlAcad.Sci) ,88:9695-9699(1991);斯科特?服(Scott,服）等人，基因組學(xué) (Genomics) ,12:1311-1313 (1992);斯科特.服(Scott,服）等人，人類(lèi)遺傳學(xué)（HumGenet), 90:327-327(1992);貝爾托拉*F度ertolaF.)等人，人類(lèi)突變，32:E2189-E2210(2011)]， 在氨基酸位置82處的H到Q的還原[SEQIDN0:8,VAR_020976 ;斯科特?服(Scott,服） 等，人類(lèi)遺傳學(xué)（HumGenet),上文引用]，在位置105處的從R到Q的改變[SEQIDN0:9， VAR_003356 ;斯科特?服(Scott,服）等人，人類(lèi)遺傳學(xué)（HumGenet),上文引用；貝爾托拉 @edola)等人，上文引用]，在位置116處的從G到R的改變[SEQIDNO: 12，VAR_003367]， 在位置279處的從V到A的改變[SEQIDNO: 11，VAR_003359]，在位置346處的從L到R 的改變[沈QIDNO: 12,VAR017436,騰，YNaeng.YN)等人，臨床遺傳學(xué)（Clin.Genet)， 57:131-136 (2000)]，在位置 361 處的從A到T的改變[SEQIDNO: 13,VAR_003364;斯科 特?服(Scott,服）等人，人分子遺傳學(xué)（HumMolGenet) ,2:1471-1473 (1993);宇佳玲加 姆燈ogalingam)等人，人類(lèi)突變（HumMutat)，24:l99-207(2004);貝爾托拉度edola)等 人，上文引用]，在位置449處的從H到N的改變[SEQIDNO: 14,VAR_066228,貝爾托拉 @edola)等人，上文引用]，在位置454處的從V到I的改變[SEQIDN0:15，VAR_003372， 宇佳玲加姆（Yogalingam)等人，上文引用；貝爾托拉度ertola)等人，上文引用]，在位置 591處的從A到T的改變[SEQIDN0:16,VAR_0066231，貝爾托拉度ertola)等人，上文引 用]，和在位置622處的從A到T的改變[SEQIDN0:17,斯科特（Scott)等人，基因組學(xué) (Genomics)，上文引用]。參見(jiàn)例如UniProt邸/Swiss-Protuniprot.org/uniprot/ P35475。在另一個(gè)實(shí)施例中，功能性人aA-艾杜糖巧酸酶可W包括合成氨基酸序列，其 中SEQIDNO:2的前26個(gè)氨基酸的全部或一部分由異源前導(dǎo)膚所替代，運(yùn)些氨基酸對(duì)應(yīng) 于前導(dǎo)（信號(hào)）膚。運(yùn)個(gè)負(fù)責(zé)將酶通過(guò)其分泌路徑轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)的前導(dǎo)膚可W由 另一種合適的前導(dǎo)膚所取代，例如，如來(lái)自白細(xì)胞介素-2 (比-2)或制瘤素的前導(dǎo)膚。優(yōu) 選合適的前導(dǎo)膚，但并不必需來(lái)自人。可W從ht1:p://p;roline.bic.nus.edu.sg/spdb/ zhang270.htm(將其通過(guò)引用結(jié)合在此）選擇合適的前導(dǎo)膚，或可W使用多種用于在選擇 的蛋白中確定前導(dǎo)（信號(hào)）膚的計(jì)算程序來(lái)確定。盡管不受限制，運(yùn)樣的序列長(zhǎng)度可W從 約15到約50個(gè)氨基酸，或長(zhǎng)度可W從約20到約28個(gè)氨基酸，或可W根據(jù)需要更長(zhǎng)或更 短。另外，至少一種體外測(cè)定已經(jīng)被描述為對(duì)評(píng)估IDUA酶的酶活性是有用的[參見(jiàn)，例 如，見(jiàn)卡其斯化akkis)等人，分子遺傳學(xué)與新陳代謝（Mol.Genet.Met油.），2001年3月； 72(3):199-208]〇
[0024] 合適地，在此所述的組合物和方法不需要長(zhǎng)期、重復(fù)每周注射治療劑量。不希望被 理論所限制，在此所述的方法被認(rèn)為對(duì)于矯正除了與MPSI障礙相關(guān)的軀體癥狀之外的中 樞神經(jīng)系統(tǒng)表型是有用的。
[00幼表達(dá)盒
[0026] 表達(dá)盒在最低限度上由基因及其調(diào)節(jié)序列構(gòu)成。當(dāng)該盒被設(shè)計(jì)成用于從重組腺相 關(guān)病毒進(jìn)行表達(dá)時(shí)，該表達(dá)盒進(jìn)一步包含5'和3'AAV反向末端重復(fù)序列（ITR)。運(yùn)些ITR 可W是全長(zhǎng)型，或運(yùn)