在一個實施例中，遞送是通過靜脈內遞送。然而，仍然 可W選擇其他給藥途徑。可替代地或另外地，希望的話，可W組合給藥途徑。
[0061] 在一個實施例中，本發(fā)明包括凍干組合物，該凍干組合物包含如在此所述的rAAV、 或凍干形式的rAAV混合物。任選地，一種或多種穩(wěn)定劑或防腐劑存在于此組合物中。合適 地，為了使用，將凍干組合物與合適的稀釋劑（例如，無菌鹽水或緩沖鹽水）進行重組。
[0062] 病毒載體的劑量將主要取決于如正被治療的病癥、患者年齡、體重和健康等因素， 并且因此在患者之間可W不同。例如，病毒載體的治療有效劑量一般在從約0.ImL到約 100血、或約0. 1血到約10血、或約0. 1血到約5血、或約0. 5血到約1血溶液的范圍，該溶 液包含濃度從約3x109到3x10"的基因組病毒載體（顆粒）/血的水懸浮劑。另一示例 性劑量是每1kg約3x109到3x10"AAV基因組。一種合適的體積是約1血。在另一個實施 例中，rAAV構建體的治療有效劑量在約0.OOlng到約1000mg/70kg動物的范圍中，其可W 用單個劑量或一系列的兩個或更多劑量來遞送?？蒞確定其他合適的劑量?？蒞調整劑量 來平衡治療益處和任何副作用，并且運樣的劑量可W取決于采用重組載體進行的治療應用 而不同。
[006引治療方法
[0064] 本發(fā)明的組合物避免了酶替代療法的并發(fā)癥，運些并發(fā)癥與對重組酶的免疫應答 相關，其范圍可W從溫和到全面過敏反應W及終生外周通路并發(fā)癥如局部和全身感染。進 一步地，與ERT相比，本發(fā)明的組合物不需要長期、重復每周注射。不希望被理論所限制，在 此所述的肝臟定向治療方法被認為對于通過提供高效、長期的由具有高轉導效率的載體所 提供的基因轉移而矯正與MPSI障礙相關的中樞神經系統(tǒng)表型是有用的，可W提供連續(xù)、升 高的循環(huán)IDUA水平，運提供了穿過血腦屏障的治療手段。另外，AAV肝臟基因轉移可W提 供積極耐受性并阻止酶抗體生成。
[0065] 提供了用于治療I型粘多糖膽積癥的方法，該方法包括遞送治療有效量的在此所 述的經修飾的hIDUA表達盒。還提供了用于治療和/或改善賀勒氏、賀勒-施艾氏和施艾 氏綜合征的癥狀的方法。
[0066] 在一個實施例中，rAAV是經靜脈內遞送的。
[0067] 在另一個實施例中，將約3x109到約3x1〇12的量的rAAV遞送給受試者。盡管預 期單次給藥rAAV是有效的，由于肝臟是再生器官，可W重復（例如，每季度、每兩年、每年 度）或如另外方式所需給藥。任選地，考慮到受試者的年齡和容忍輸注的能力，可W經分離 的輸注區(qū)段遞送治療有效量的初始劑量。然而，不需要全治療劑量的重復每周注射，運為患 者提供在舒適度和治療結果兩方面的優(yōu)勢。
[0068] W下實例僅是說明性的并且不是對在此所述的發(fā)明的限制。
[0069] 實例1-轉基因和載體生產
[0070] 合成了編碼功能性人a寸-艾杜糖巧酸酶的經修飾的核巧酸序列。所得序列尤 其特別適合于人表達并且與功能性人IDUA基因化IDUA;基因庫（Genbank)NP000194. 2)具 有小于約90%的一致性。然后將所得轉基因插入到質粒中，質粒包含使用工程化Mlul和 Sail位點包裝到可從賓夕法尼亞大學載體核屯、（UPennVectorCore)獲得的AAV載體中所 必需的順式元件?；虮磉_由人甲狀腺素結合球蛋白（TBG)所驅動[林YOlayashiY)，莫 里'Y(MoriY)，詹森'OECJanssen0巧等人，人甲狀腺素結合球蛋白基因：全序列和轉錄調 節(jié)（Humanthyroxine-bindingglobulingene:completesequenceandtranscriptional regulation),分子內分泌學（MolEndocrinol), 1993;7:1049 - 1060]。所得質粒（如圖 2 中所示）祀順.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB包含受包括肝臟特異性TBG啟動子的表達控制序列 控制的經修飾的hIDUA基因。質粒還包含AAV25' 口R、amic/bic增強子的串聯(lián)重復序列、 TBG啟動子、普洛麥格內含子序列、經修飾的人IDUA基因SEQIDN0:1、兔球蛋白polyA、和 AAV2-3'ITRo
[0071] 進行了大規(guī)模載體制備，基本上如由洛克化ock)等人所描述[重組腺相關病毒 載體的規(guī)?；焖佟⒑唵?、和通用制造（Rapid,simple,andversatilemanufac1:u;ringof recombinantadeno-associatedviralvectorsatscale)，人類基因治療化umGene Ther)，21 (10) : 1259-1271. (2010)]。在包含肥K293細胞的75%的融合單層的10層細胞堆 中進行了基于PEI的轉染。對來自細胞堆的1化原種培養(yǎng)基進行澄清并然后由切向流過濾 進行濃縮。經艦克沙醇的ptipr巧；西格瑪化學公司（Sigma化emicalCo.)，圣路易斯，密 蘇里州）梯度對經濃縮后的澄清原種進行純化。收集并合并在可見污染蛋白帶正下方的所 有部分。對合并的部分在PBS/35mM的化C1中進行滲濾并使用離屯、超濾（AmiconUltra)15 自旋濃縮器（密理博公司（Millipore))進行濃縮。將甘油添加到滲濾后的濃縮產品達到 最終5%并且對制劑進行等分并儲存在-8(rC下。所得載體在此被稱為AAV8.TBG.hIDUA或 AAV2/8.TBG.hIDUA。在某些位置，重組AAV顆粒被稱作AAV8.TBG.hIDUAco或AAV2/8.TBG. hIDUAco。質粒還包含AAV25' 口R、amic/bic增強子的串聯(lián)重復序列、TBG啟動子、普洛麥 格內含子序列、經修飾的人IDUA基因SEQIDN0:1、兔球蛋白polyA、和AAV2-3'口R。
[0072] 實例 2-
[007引 A、基于細胞的測定
[0074] 將肥K293細胞維持在生長培養(yǎng)基中，該生長培養(yǎng)基包含具有5 %胎牛血清（FBS; XX訝、1 %青霉素/鏈霉素（p/s;生命技術公司化ifeTechnologies?))的杜氏改良培 養(yǎng)基值MEM;規(guī)b㈱狡，生命技術公司（LifeTechnologies?))。根據(jù)制造商的推薦使用LipofectamineTM2000 (英杰公司（Invitrogen?)，生命技術公司（XifeTechnologies?)) 進行質粒DM轉染。簡言之，將細胞W5x10、細胞/孔的密度鋪板于轉染培養(yǎng)基 值MEMW%FBS，無p/s)中的6孔組織培養(yǎng)皿中并且允許其在5%C02中在37。下粘 附過夜。第二天，檢查細胞90%-95%融合并且更新培養(yǎng)基。將質粒DNA和脂質體轉 染化ipofectamine?)2000用Opti-MEMI飯減血清培養(yǎng)基（無血清）稀釋到最終比率 1:2. 5 值NA:LipofectamineTM2000)。在與DNA溶液進行混合前，將LipofectamineTM2000 轉染溶液在22°C下解育五分鐘。在添加到包含細胞和培養(yǎng)基的孔之前，將運個包含DM: LipofectamineTM2000溶液的最終轉染混合物進一步解育20分鐘（22°C)。模擬細胞不接 受質粒DNA并且編碼eGFP的質粒被用作轉染對照。針對每個測試的構建體，對S個孔進 行轉染。在5%C〇2中在37°下解育細胞；在四個小時后用生長培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。每個 孔的內容物在72個小時后收獲并且在4°C下W4000rpm收集15分鐘。將細胞重新懸浮在 100y1/孔的裂解緩沖液（0. 2%TritonX-100,0. 9%化C1，抑4. 0)中并且用滿旋冷凍/ 解凍S次。此外，在最終冷凍/解凍前，用Benzonase在37°C下對裂解物處理30分鐘。W 1000化pm(4°C)沉淀細胞碎片10分鐘并且將最終澄清的細胞裂解物放到冰上并立即測定 酶活性。
[0075] B、組織裂解和蛋白提取
[0076] 在一層干冰上在盒子中對冷凍的組織進行半解凍并且將小片濕組織切（約20mg、 約lOmg脾臟）到小培養(yǎng)皿中。然后將預處理過的組織浸沒在2-ml具有1ml裂解緩沖液 (0. 2%TritonX-100,0. 9% 化C1，抑 4. 0)和 5mm鋼珠的埃彭道夫離屯、管（eppendo;rph) 中。在組織裂解器上W30化對樣本進行勻漿2分鐘。攬勻的樣本WeOOOrpm簡單旋轉30 秒并且移除了 5mm鋼珠。使用1-1/16"直徑微號角用聲處理對組織裂解物進行進一步破壞 并且將其在-80°C下冷凍過夜。第二天在22°C下對處理過的樣本進行解凍并且通過離屯、 (10000巧m/10分鐘/4°C)對其進行澄清。在測定前將來自腦部、或其他脂肪組織的漂浮脂 質層吸出。然后將樣本儲存在濕冰上并立即測定酶活性。
[0077]C、蛋白估算
[007引遵循制造商規(guī)程，使用基于考馬斯（Coomassie)的布拉福德度ra壯ord)測定法 (賽默科技公司（ThermoScientific))來估算總蛋白。簡言之，使用牛血清白蛋白度SA) 設置標準曲線來生成從1到25yg/ml的工作范圍和無BSA的蛋白稀釋緩沖液導致的空白。 從1/300到1/1200來兩倍稀釋樣本并且W1:1比率的稀釋蛋白：布拉福德試劑在96孔平 皿中進行混合。允許樣本在22°C下平衡15分鐘并且在讀板機上W建議的595nm波長對吸 光度值進行收集。使用標準曲線和空白校正將原始值轉換成yg/ml濃度。然后對微克數(shù) 量進行轉換并且W毫克進行報告。
[007引 D、酶活性測定
[0080] 根據(jù)先前公開的方法[卡其斯化akkis)等人，分子遺傳學與新陳代謝（Mol. Genet.Met油.），2001年3月；72 (3) : 199-20引將4-甲基傘形酬基aA-化喃艾杜糖醒酸、 環(huán)己基錠鹽（4-MU-Ido;多倫多研究化學品公司（TorontoResearchQiemicals,Inc.))用 作底物對IDUA酶活性進行測定。簡言之，用重蒸饋水（dd&O)和lOOy1lOOyM4-MU-Ido 底物使5-15y1裂解物、或血清達到100ii1，用反應緩沖液化IM乙酸鋼抑3. 5,0. 15M 化C1，0. 05%TritonX-100)進行稀釋，在丙締酸甲醋比色皿（賽默科技公司燈hermo Scientific))中組合。在37°C水浴中將反應解育1-3小時并且W添加lx終止緩沖液 (290mM甘氨酸，180mM碳酸鋼，pH10. 5)結束。通過UV通道巧X365nm，血440-470nm)在 如antiFluor?-ST(普洛麥格（Promega))上讀出結果。原始巧光值被記錄并且使用4-甲 基傘形酬（M-5410;生物合成（Biosynth? ))的已知量的標準曲線將其轉換成nmol/ml/ 虹。將細胞和組織裂解物歸一化成估算的蛋白值（nmol/mg/虹；見題為"蛋白估算"的方法 章節(jié)）。
[0081]E、DNA提取和基因組拷貝分析
[0082] 使用化qmanPCR來確定二倍體細胞中的載體DNA負載。對于實時PCR進行的載 體基因組的檢測和量化，使用QIAampDNA迷你試劑盒（QIAampDNAMiniKit)(凱杰公司 (Qiagen)，瓦倫西亞，加利福尼亞州，美國）從組織中提取總細胞DM。引物和探針組被設計 成用于祀向載體的nRBGpolyA區(qū)域，使用如下序列證向：GCCAAAAATTATGGGGACAT，反向：
[0083]ATTCCAACACACTATTGCAATG，探針：6FAM-ATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCT-TAMRA。用 Cis質粒建立用于載體基因組量化的標準曲線，cis質粒用于相應載體的生產。用化qMan 通用PCR預混合物（應用生