與豌豆抗白粉病等位基因er1-6共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病理學(xué)、遺傳育種及分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一 種與豌S?抗白粉病等位基因erl-6共分尚的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由白粉菌（Erysiphe pisi D. C.)引起的豌豆白粉病是世界性病害（Nisar et al.，2011;Fondevilla et al.，2012)。在我國南、北豌豆產(chǎn)區(qū)均有豌豆白粉病的發(fā)生。氣 候條件適宜的情況下，感病品種的侵染率高達(dá)1〇〇%，極大地影響豌豆產(chǎn)量和品質(zhì)，造成嚴(yán) 重的經(jīng)濟(jì)損失（彭化賢等，1991)。防治豌豆白粉病最為經(jīng)濟(jì)、有效且環(huán)境安全的方法是種 植抗病品種。目前，國外已經(jīng)鑒定了大量的抗白粉病豌豆資源，并在抗性資源中鑒定了 3個 獨立遺傳的抗白粉病基因（erl，er2，er3) (Harland et al.，1948 ;Heringa et al.，1969) 〇 迄今，除在豌豆資源JI 2480中鑒定抗病基因er2和在豌豆野生種P. fulvum中鑒定er3外， 大量抗性資源篩選和遺傳分析方面的研究表明，許多不同地理起源的抗白粉病豌豆資源的 抗性均由 erl 基因控制（Tiwari et al.，1997 ;Ghafoor et al.，2012 ;Liu et al.，2003 ; Vaid et al.，1997)。目前生產(chǎn)中應(yīng)用的抗白粉病豌豆資源的抗性均由erl控制。erl基 因具有廣譜、持久抗性，已在歐洲、北美洲及澳大利亞的豌豆育種中廣泛應(yīng)用（Fondevilla et al.，2007)?？共』騟rl和er2分別被定位在豌豆遺傳圖譜的第6連鎖群（LG VI) (Timmerman et al.，1994)和第 3 連鎖群（LGIII) (Katoch et al.，2010)。
[0003] 最近研究發(fā)現(xiàn)，豌豆抗白粉病基因erl是由感病基因PsMLO功能喪失而產(chǎn)生的 (Humphry et al.，2011;Pavan et al.，2011)。在自然和誘變條件下，豌豆PsMLO同源序列 發(fā)生堿基缺失、插入、替換等導(dǎo)致不同的erl等位基因產(chǎn)生，目前已經(jīng)鑒定了 5個erl等位 基因即 erl-l、erl-2、e;rl-3、e;rl-4^Ple;rl-5(Humphryetal.，2011;Pavanetal.，2011) 〇 除了 erl-2是由大片段的插入和缺失產(chǎn)生的，其他4個等位基因都是由單堿基的缺失、插 入、替換產(chǎn)生的。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在分子輔助育種中的廣泛應(yīng)用，Pavan等（2013)基于 不同的分子標(biāo)記技術(shù)，開發(fā)了已鑒定的erl的5個等位基因的功能標(biāo)記，但這些功能標(biāo)記的 有效性尚未被驗證。高分辨率恪解曲線（High Resolution Melting, HRM)分析技術(shù)是近年 來興起的一種檢測基因單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP)的新技 術(shù)（Kristensen et al.，2008)〇
[0004] 最近研究人員在中國豌豆地方品種中篩選出了一些白粉病免疫資源（王仲怡等， 2012)。通過erl的候選基因PsMLO序列分析在中國豌豆地方品種中鑒定了一個新等位基因 erl-6,該基因在PsMLOlcDNA序列開放閱讀框第1121個堿基處發(fā)生突變，T替換為C，這一 堿基突變導(dǎo)致氨基酸序列由亮氨酸變成脯氨酸，從而引起蛋白功能的變化。為加速分子輔 助選擇育種，開發(fā)與等位基因erl-6共分離的功能性分子標(biāo)記成為亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與豌豆抗白粉病等位基因erl-6共分離的分子標(biāo)記及 其應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與豌豆抗白粉病等位基因erl-6共分離的分 子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記位于豌豆遺傳圖譜第VI連鎖群上，與等位基因erl-6的遺傳距離為 OcM，用于PCR擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的特異性引物對如下，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為158bp ;
[0007] 上游引物 F: 5 ' -CTGGAGATCACCTTITCTGGIT-3 ' 和
[0008] 下游引物 R : 5 ' -CATGTACAAACACACATACACACG-3 '。
[0009] 其中，PCR擴(kuò)增使用的退火溫度為59°C。
[0010] 本發(fā)明還提供所述的分子標(biāo)記在鑒定豌豆抗白粉病種質(zhì)資源中的應(yīng)用。
[0011] 具體地，所述應(yīng)用包括以下步驟：
[0012] 1)提取待測婉的基因組DNA ;
[0013] 2)以待測豌豆的基因組DNA為模板，利用所述的用于PCR擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的特 異性引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0014] 3)利用HRM分析技術(shù)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0015] 其中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以10 y 1計為：豌豆基因組DNA25ng，10XPCR 反應(yīng)緩沖液（25mM MgCl2)lyl，5mM 引物R).25yl，5mM 引物R 0.25yl，10XHRM Fast Master Mix (HRM Fast PCR Kit, Kapa Biosystems，USA) 5 yl，ddH20 補(bǔ)足至 10 yl〇
[0016] PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95°C 5分鐘；94°C 10秒，59°C 30秒，72°C 10秒，50個循 環(huán)；72 °C 10分鐘。
[0017] 本發(fā)明利用HRM分析技術(shù)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所有含有等位基因erl-6的豌豆資 源均出現(xiàn)一條相同的熔解曲線，而其他抗病或感病豌豆資源均形成另外一條與erl-6明顯 不同的熔解曲線。
[0018] 本發(fā)明還提供用于PCR檢測抗白粉病豌豆資源的試劑盒，所述試劑盒中含有所述 的用于PCR擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的特異性引物對。
[0019] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、HRM Fast Master Mix、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的至少一種。
[0020] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述的分子標(biāo)記在植物分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明還提供含有上述引物對的用于檢測抗白粉病豌豆的試劑盒。優(yōu)選所述試 劑盒還包括上述 Master Mix (Tiangen)和 HRM Fast Master Mix (HRM Fast PCR Kit, Kapa Biosystems, USA)和標(biāo)準(zhǔn)陽性模板中的一種或多種。
[0022] 具體地，本發(fā)明的與豌豆抗白粉病erl等位基因erl-6共分離的分子標(biāo)記是通過 以下方法獲得的：
[0023] 利用抗病品種G0001778與感病品種壩豌6號的PsMLOl cDNA序列的SNP差異 (T - C)，在PsMLOl cDNA序列SNP突變位點兩側(cè)分別設(shè)計引物，開發(fā)與豌豆抗白粉病等位 基因erl-6共分離的分子標(biāo)記，隨后，將該標(biāo)記用于鑒定抗病親本G0001778與感病親本壩 豌6號雜交衍生的匕群體的各單株的基因型，通過HRM技術(shù)分析，該標(biāo)記在F 2群體中出現(xiàn) 三種明顯不同的熔解曲線，分別對應(yīng)于純合抗病基因型、純合感病基因型和雜合基因型三 種類型。這三種基因型與F 3群體的表現(xiàn)型一一對應(yīng)。證明該標(biāo)記為與抗病基因erl-6共 分離的分子標(biāo)記。隨后，將所述分子標(biāo)記用于鑒定豌豆抗白粉病資源。結(jié)果表明，所述分子 標(biāo)記能夠有效區(qū)分出含有抗白粉病等位基因erl-6的豌豆資源。本發(fā)明為豌豆抗白粉病分 子輔助選擇育種提供分子標(biāo)記，從而加速豌豆抗白粉病育種工作進(jìn)程。 具體實施方案：
[0024] (1) erl-6的功能分子標(biāo)記開發(fā)
[0025] 根據(jù)含有erl-6的抗病品種G0001778和感病品種壩豌6號的候選基因PsMLOl序 列比對結(jié)果，erl-6與PsMLOl cDNA序列之間存在單堿基差異（1121處，T - C)，用Primer Premier 5.0軟件在序列SNP突變位點兩側(cè)設(shè)計引物，開發(fā)功能性標(biāo)記。該標(biāo)記的上、下游 引物分別位于PsMLOl基因的第11個外顯子和第11個內(nèi)含子上。引物由生工生物工程（上 海）有限公司合成。
[0026] 首先，用G0001778和壩豌6號基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測引物的有效 性，隨后利用HRM分析技術(shù)檢測親本間的多態(tài)性。通過HRM分析，發(fā)現(xiàn)一個分子標(biāo)記在抗、感 品種上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物形成了兩種明顯不同的熔解曲線，說明該標(biāo)記在抗病品種G0001778 和感病品種壩豌6號間具有多態(tài)性。隨后將開發(fā)的親本間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記用于鑒定 抗病親本G0001778和感病親本壩豌6號雜交衍生的F 2群體的71個單株的基因型。發(fā)現(xiàn) 該標(biāo)記在匕群體中形成明顯不同的三種熔解曲線，分別對應(yīng)于純合抗病、純合感病和雜合 三種基因型，這三種不同的曲線與F 3群體的性狀表現(xiàn)型一一對應(yīng)（圖1)，這表明所述分子 標(biāo)記是與erl-6共分離的共顯性功能標(biāo)記。
[0027] (2)功能分子標(biāo)記的應(yīng)用
[0028] 將開發(fā)的分子標(biāo)記在豌豆抗白粉病資源鑒定中進(jìn)行應(yīng)用和功能驗證。結(jié)果表明， 在所有檢測的豌豆資源中，均能擴(kuò)增出一條158bp的目的條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)HRM技術(shù)分析，所 有含有抗白粉病等位基因erl-6的豌豆資源，均出現(xiàn)一條相同的熔解曲線（圖3)。而含有 其它erl等位基因erl-l、erl-2、erl-4的豌豆資源以及感病資源均形成另外一條與erl-6 明顯不同的熔解曲線（圖3)。分析結(jié)果證明所述分子標(biāo)記能夠準(zhǔn)確區(qū)分含抗病等位基因 erl-6的豌豆資源。此結(jié)果驗證了所述分子標(biāo)記在豌豆抗白粉病資源鑒定中的有效性。
[0029] 本發(fā)明開發(fā)了與豌S?抗白粉病等位基因erl-6共分尚的分子標(biāo)記，該抗病基因 erl-6是在我國豌豆資源中鑒定的，對我國豌豆白粉病具有廣譜抗性，可有效控制我國豌豆 白粉病的發(fā)生，減輕該病害造成的產(chǎn)量損失?；赑CR擴(kuò)增和HRM分析技術(shù)，將與該基因共 分離的分子標(biāo)記有效的應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助育種中，克服常規(guī)育種方法所需要的周期長的 缺點；HRM具有高通量、操作簡便的優(yōu)點；本發(fā)明利用HRM技術(shù)開發(fā)的分子標(biāo)記在豌豆生產(chǎn)、 育種工作和抗病機(jī)理的研究中具有重要價值。其優(yōu)點在于：
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