與控制黃瓜果刺有無基因Tril共分離的顯性分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標(biāo)記,特別設(shè)及一個與控制黃瓜果刺有無基 因 Tri 1共分離的顯性分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜(Cucumis sativus L.)是葫蘆科(Cucurbi1:aceae)黃瓜屬(Cucumis) -年蔓 生的草本植物,黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一,也是我國主栽蔬菜作物之一。果實 是黃瓜經(jīng)濟性狀最重要的部分,黃瓜果實屬于輒果,由子房和花托共同發(fā)育而成。果刺是表 皮毛在果實上的形態(tài)高度特化,也是重要的果實性狀。果刺的有無性狀是由Trichome-less (Tril)基因調(diào)控,有果刺的野生性狀(Tril)為顯性,無果刺的突變體性狀(tril)為隱性。關(guān) 于黃瓜果刺的研究報道,最早可追述到1997年,華北類型黃瓜地方品種"大青把"自交后代 的微毛自然突變體被發(fā)現(xiàn),其表現(xiàn)為莖、葉、專片、果實表面均覆蓋肉眼難察覺的微毛,并被 命名為"glabrous(gl)"。通過遺傳分析發(fā)現(xiàn),該微毛基因為隱性突變,基因被進(jìn)一步克隆和 分子驗證。隨后發(fā)現(xiàn)歐洲溫室黃瓜類型的自然突變體,該突變體表現(xiàn)為莖、枝、葉、卷須、花 瓣、專片及子房表面均無表皮毛,果實無刺無瘤,被命名為叮richome-less(Triir。通過遺 傳分析發(fā)現(xiàn),該突變同樣為隱性突變,并將其等位顯性基因命名為Tril。無果刺tril突變成 株和微毛gl突變體成株均表現(xiàn)為表皮無可見毛無可見果刺,用肉眼難W區(qū)分,前人也沒有 對化il候選基因進(jìn)行進(jìn)一步的定位和分析。
[0003] 圖位克隆(Map-based cloning),可在基因產(chǎn)物未知的情況下,利用分離群體的遺 傳連鎖分析或染色體的異常,將目的基因定位到染色體的一個具體位置,找到與其緊密連 鎖的分子標(biāo)記,不斷縮小候選區(qū)域進(jìn)而克隆基因。最常用的標(biāo)記篩選方法是分離體分組混 合分析法(Bulked segregant analysis,BSA),該方法在一對具有目的基因表型差異的親 本所構(gòu)建的分離群體中,根據(jù)目的基因的表型,分別選取相同數(shù)量的個體,構(gòu)成兩個亞群, 將每個亞群中個體的DNA等量混合,形成兩個相對性狀的"基因池 "(Gene pool),然后用合 適的分子標(biāo)記對兩個基因池進(jìn)行分析,在兩池間表現(xiàn)出多態(tài)性的分子標(biāo)記與目的基因座位 相連鎖,再利用分離群體進(jìn)一步檢測所得分子標(biāo)記與目的基因的連鎖程度,從而確定其在 已知分子圖譜或染色體上的位置。由于構(gòu)建基因池使用了特定的分離群體,且在分組時僅 對目的基因表型進(jìn)行選擇,運樣保證了其他性狀的遺傳背景基本相同,兩個基因池之間理 論上應(yīng)主要在目的基因區(qū)段存在差異,排除了環(huán)境及人為因素的影響,使研究結(jié)果更為準(zhǔn) 確可靠。和目的基因有緊密連鎖的分子標(biāo)記具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點,可 在苗期進(jìn)行選擇,加快育種的進(jìn)程。
[0004] 隨著人們生活水平的提高,黃瓜品質(zhì)育種已提上日程。黃瓜果刺性狀屬于果實感 觀品質(zhì)范疇。歐美溫室類型的黃瓜為無果刺的果皮,稱其為水果黃瓜,其市場價格為普通黃 瓜的2-3倍。外觀光滑黃瓜污染少,清洗方便,食用衛(wèi)生,是無公害蔬菜的理想品種。經(jīng)檢測 表明:無刺黃瓜果肉農(nóng)藥殘留量比有刺黃瓜低27%,果皮農(nóng)藥殘留量低18%。黃瓜果刺基因 化il控制果刺的發(fā)育和形成,它的研究將會推動黃瓜品質(zhì)育種進(jìn)程。用與目的性狀共分離 連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中是十分有效的方法。穩(wěn)定遺傳的無刺 突變體為黃瓜果刺形成機理研究提供了理想的材料,其和有刺親本的Fi群體表現(xiàn)為少刺, 為黃瓜培育少刺新品種提供了穩(wěn)定無刺親本。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的,在于提供一個與控制黃瓜果刺有無基因 Tril共分離的顯性分子標(biāo) 記。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007] 一個與控制黃瓜果刺有無基因化il共分離的顯性分子標(biāo)記,命名為CoT-01,其核 巧酸序列如SEQ ID N0.1所示,所述CoT-01與有果刺基因化il連鎖,無果刺基因 tril不能擴 增出特異性片段。
[000引所述防1'-01由569 10^).2所示的上游引物和569 10^).3所示的下游引物擴增 得至Ij,擴增程序為:94°C5分鐘;94°C30秒,60°C30秒,72°C30秒,35個循環(huán);72°C5分鐘。
[0009] 引物由上海生工科技有限公司合成。
[0010] 本發(fā)明利用微毛突變體gl和無果刺突變體tril雜交的1058株F2分離群體,通過表 型分析確定了黃瓜果刺有無性狀和微毛性狀非等位基因,且果刺性狀屬于單基因顯性性 狀。后分別取每株嫩葉提取基因組DNA,結(jié)合BSA法篩選與Tril基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。利 用高密度圖譜分子標(biāo)記,最終提供一個與黃瓜果刺基因化il共分離連鎖的標(biāo)記,經(jīng)鑒定座 落在化il基因內(nèi),該分子標(biāo)記的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠即可簡單區(qū)分果刺的有無,便于區(qū)分肉 眼難W辨別的微毛和無果刺突變體黃瓜品系,和無果刺分子標(biāo)記輔助育種體系的建立。本 發(fā)明的分子標(biāo)記可簡便、快捷、高通量的應(yīng)用與育種實踐。
【附圖說明】
[0011] 圖1為分子標(biāo)記CoT-Ol對F2群體的篩選效果。
【具體實施方式】
[0012] -、F2代分離群體的構(gòu)建
[0013] 構(gòu)建F2群體所用到的無刺突變體為歐洲溫室突變體tril。微毛品種。本實施例利 用運兩個親本配制Fi代,F(xiàn)i代自交產(chǎn)生F2代群體。在多種F2群體鑒定有/無果刺表型,最后分 析Fi表型和F2分離比,卡方分析法進(jìn)行驗證,得出黃瓜果刺性狀屬于單基因控制的顯性性 狀。
[0014] 二、黃瓜基因組DNA的提取
[0015] 用CTAB法提取親本及F2分離群體葉片的基因組總DNA。取剛剛展開的一片真葉至 2血離屯、管中并加入液氮,研磨組織成粉末狀,加入70化1 CTAB裂解緩沖液,劇烈振蕩30秒, 60°C水浴1小時,期間上下顛倒5次充分混勻。向上述勻漿裂解液中加入700化氯仿異戊醇 (24:1,v/v),上下顛倒充分混勻,13200巧m 4°C離屯、15分鐘。吸取上清液50化L至新的離屯、 管中,加入等體積異丙醇,上下顛倒充分混勻,于一20°C靜置30分鐘,12000rpm 4°C離屯、15 分鐘。棄上清,沿離屯、管壁加入75%乙醇,上下顛倒洗涂離屯、管管壁,12000巧m 4°C離屯、5分 鐘后棄去乙醇。室溫干燥沉淀,加入10化L RNA酶TE緩沖液(7:993,v/v)溶解,37°C水浴30分 鐘,核酸儀測定DM濃度后用TE緩沖液稀釋終濃度為30ngAiL,于一20°C備用。
[0016] S、SSR標(biāo)記掃描F2分離群體
[0017] 利用本發(fā)明開發(fā)的分子標(biāo)記掃描上述F2分離群體,尋找標(biāo)記型與性狀表現(xiàn)型的差 別單株,獲得標(biāo)記與Tri 1基因的交換單株。PCR體系50化:1 X Taq Buf f er,1.5mmol/L MgCl2,200ymol/L dNTPs,引物各0.2ymol/L,30ng模板DNA,0.5U Taq DNA Polymerase,總 反應(yīng)體系為IO^dPCR程序:94°C5分鐘;35個循環(huán),94°C30秒,60°C30秒,72°C30秒;72°C5分 鐘。在PCR產(chǎn)物中加入BioTeke SYBR Green I核酸染料化L,4°C靜置15分鐘使染料與DNA結(jié) 合,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,在紫外燈下切下目的片段,使用了曰1(曰1?曰11111865了 Agarose Gel DNA Extraction Kit回收純化DNA片段,具體步驟參照試劑盒說明書,產(chǎn)品編 號9762。將純化片段送由上海生工科技有限公司測序,測序結(jié)果通過化romas 2.3軟件分 析。
[0018] CoT-1分子標(biāo)記經(jīng)過F2分離群體驗證,均與化il基因位點共分離,無交換株出現(xiàn), 且特異性PCR具有高穩(wěn)定特征。利用CoT-1分子標(biāo)記將有助于黃瓜微毛和無果刺品系的區(qū) 分,W及黃瓜有無果刺植株的篩選。
[0019] 圖1為分子標(biāo)記CoT-01對F2群體的篩選效果。圖中所示,M:marker 1,t;ril:無果刺 突變體,WT:野生型9930,F(xiàn)洗果刺群體和F2有果刺群體分別表示在glxtril F2群體中隨機 挑選的10株無果刺和10株有果刺植株。
[0020]
【主權(quán)項】
1. 一個與控制黃瓜果刺有無基因 Tril共分離的顯性分子標(biāo)記,命名為CoT-01,其核苷 酸序列如SEQ ID N0.1所示,所述CoT-01與有果刺基因 Tril連鎖,無果刺基因 tril不能擴增 出特異性片段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與控制黃瓜果刺有無基因 Tril共分離的顯性分子標(biāo)記,其特 征在于:所述CoT-01由SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物擴增得 至丨J,擴增程序為:94°C5分鐘;94°C30秒,60°C30秒,72°C30秒,35個循環(huán);72°C5分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一個與控制黃瓜果刺有無基因Tril共分離的顯性分子標(biāo)記,命名為CoT-01,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示,所述CoT-01與有果刺基因Tril連鎖,無果刺基因tril不能擴增出特異性片段。本發(fā)明的分子標(biāo)記和Tril基因位點共分離,對黃瓜微毛和無毛品系的區(qū)分有很大幫助;且具有高穩(wěn)定性,可以在黃瓜苗期便可簡便、快速地區(qū)分有無果刺表型,可應(yīng)用于相關(guān)的分子標(biāo)記輔助育種中。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105543218
【申請?zhí)枴緾N201610043923
【發(fā)明人】王云莉, 蔡潤, 潘俊松, 何歡樂
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月22日