一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]流行病學(xué)和臨床研究證實大約25%的成人腫瘤由慢性炎癥引起。例如，胃、肝臟及宮頸的慢性病毒或細(xì)菌感染、以及肺長期暴露于煙草煙霧或其它環(huán)境化合物，均會明顯促使這些器官的慢性組織損傷及隨后的腫瘤發(fā)生[I]。慢性炎癥與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。普通人群胰腺癌發(fā)病率約為0.007%[3]，慢性胰腺炎患者的胰腺癌的發(fā)病率增至4%，而遺傳性胰腺炎患者的胰腺癌的發(fā)病率則高達(dá)40%[4]?？寡字苿┑膽?yīng)用與結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌及胃癌發(fā)病率的降低有關(guān)[I]。盡管炎癥與癌癥的關(guān)系已經(jīng)明確，且被稱為“癌癥的第七大特征” [I]，但慢性炎癥在癌癥中發(fā)揮作用的潛在機制仍未明了，慢性炎癥促進(jìn)腫瘤細(xì)胞迀移、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機制仍有待深入研究。目前關(guān)于炎癥促進(jìn)胰腺癌生長轉(zhuǎn)移的研究仍局限于體外細(xì)胞水平，即采用各種炎癥因子處理胰腺癌細(xì)胞，觀察對細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移能力的影響。但體外細(xì)胞水平的研究具有一定的局限性，首先，炎癥因子種類眾多，單一的炎癥因子刺激或幾種炎癥因子的組合均難以反映活體內(nèi)的真實情況；其次，體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)的真實情況差異巨大，體內(nèi)環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞處于三維生長狀態(tài)，且受到間質(zhì)細(xì)胞、新生血管生成、多種炎癥細(xì)胞浸潤等諸多因素的影響。因此，研究炎癥對胰腺癌生長轉(zhuǎn)移的影響，有必要建立活體的動物模型，但目前尚無成功的范例。
[0003]建立用于研究慢性炎癥對胰腺癌演進(jìn)過程影響的動物模型，需要從兩方面入手，一方面，需在實驗動物的胰腺組織上誘導(dǎo)出或移植入胰腺癌，建立胰腺原位的腫瘤模型；另一方面，需要在實驗動物上誘導(dǎo)出胰腺炎。兩方面相結(jié)合，方可建立具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型。裸鼠胰腺原位移植瘤模型，是目前比較經(jīng)典的胰腺原位腫瘤模型[5]。通過將人胰腺癌細(xì)胞注入裸鼠胰腺包膜下，可在裸鼠胰腺上生長出胰腺癌。二丁基二氯化錫(dibutyltin dichloride, DBTC)尾靜脈注射，是目前常用的動物胰腺炎誘導(dǎo)方法[6]。其原理在于，DBTC是一種脂溶性物質(zhì)，可經(jīng)肝臟、膽囊排泄至胰管，引起胰管的細(xì)胞壞死和上皮增生，進(jìn)而阻塞胰管，誘發(fā)胰腺炎。目前已證實的能夠被DBTC誘導(dǎo)出胰腺炎的實驗動物包括Sprague-Dawley (SD)大鼠和C57BL/6 (B6)小鼠。但目前尚未證實裸鼠能否被DBTC誘導(dǎo)出胰腺炎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]解決的技術(shù)問題:針對目前尚未證實裸鼠能否被DBTC誘導(dǎo)出胰腺炎，本發(fā)明提供一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，該方法證實了裸鼠能夠被DBTC誘導(dǎo)出胰腺炎，并確定了裸鼠中DBTC的使用的合適劑量，在此基礎(chǔ)上，將裸鼠胰腺原位移植瘤模型與DBTC誘導(dǎo)的裸鼠胰腺炎模型相結(jié)合，成功建立了具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌模型。
[0005]技術(shù)方案:一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，步驟如下: 第一步，pLVX-luciferase-1RES-ZsGreenl 質(zhì)粒的構(gòu)建:
1)通過下列反應(yīng)體系和條件制備得到pLVX-1RES-ZsGreenl酶切產(chǎn)物和pGL3_Basic酶切產(chǎn)物，其中 DNA 為 pLVX-1RES-ZsGreenl 和 pGL3_Basic 質(zhì)粒，
反應(yīng)體系:
DNA,I μ g
10XNEbuffer4+BSA,3 μ L
內(nèi)切酶XhoI，I單位
內(nèi)切酶XbaI，I單位
加滅菌超純水至體積30 μ L
反應(yīng)條件:37°C水浴2h
2)將pGL3-Basic酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含1700bp大小的DNA片段的凝膠塊，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到luciferase DNA片段，
3)將pLVX-1RES-ZsGreenl酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含8400bp大小的DNA片段，并采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的pLVX-1RES-ZsGreenl 酶切產(chǎn)物，
4)采用T4DNA連接酶和快速連接試劑盒，將luciferase DNA片段與純化后的pLVX-1RES-ZsGreenl酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，
5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選，得到抗性篩選后的單克隆菌落，
6)將抗性篩選后的菌落進(jìn)行陽性克隆篩選，得到pLVX-luciferase-1RES-ZsGreenl質(zhì)粒;
第二步，慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達(dá)系統(tǒng)的建立:
將pLVX-luciferase-1RES-ZsGreenl質(zhì)粒與輔助包裝原件載體質(zhì)粒pspax2和pMD2G用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，即得慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達(dá)系統(tǒng)；
第三步，穩(wěn)定表達(dá)luciferase的胰腺癌細(xì)胞系的建立:
將慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達(dá)系統(tǒng)加入胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染細(xì)胞，受感染的細(xì)胞，luciferase基因可整合至細(xì)胞基因組中，形成穩(wěn)定表達(dá)luciferase的細(xì)胞，以終濃度4 μ g/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)luciferase的細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)luciferase的胰腺癌細(xì)胞系；
第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立:
①將IX 17個穩(wěn)定表達(dá)luciferase的胰腺癌細(xì)胞系，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為100 μ L，細(xì)胞密度為I X 1VlOO μ L，再與100 μ L Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，
②采用胰島素注射器，將50μ L細(xì)胞懸液注射入裸鼠胰腺包膜下，即得裸鼠胰腺原位移植瘤模型；
第五步，炎癥模型的建立:
以濃度為80%的乙醇為溶劑溶解DBTC，配制成3.2mg/mL的母液，在裸鼠胰腺原位移植瘤模型建立后第三天，將母液用等體積PBS稀釋后進(jìn)行DBTC尾靜脈注射，即得炎癥模型，其中按2mg/kg體重計算DBTC用量；
第六步，具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立:
繼續(xù)飼養(yǎng)裸鼠30天，在裸鼠體內(nèi)即建立具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌模型。
[0006]上述所述的第一步的2)和3)中采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化的步驟相同，具體步驟是:
①在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，計算凝膠重量，該重量作為一個凝膠體積；
②將凝膠放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3個凝膠體積的BufferDE-A,混合均勻后于75°C加熱，間斷混合直至凝膠塊完全熔化；
③再加入0.5個凝膠體積的Buffer DE-B，混合均勻，得到混合液；
④吸取步驟③中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，OOOXg離心力下離心I min，棄濾液；
⑤將制備管置回2mL離心管，加入500 μ L Buffer Wl，在12，000 Xg離心力下離心30 S，棄濾液;
⑥再將制備管置回2mL離心管，加入700 μ L Buffer W2，在12，000 Xg離心力下離心30 S，棄濾液，再加入700 μ L Buffer W2，在12，OOOXg離心力下離心I min，棄濾液;
⑦將制備管置回2mL離心管中，在12，000Xg離心力下離心Imin ；
⑧將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備膜中央加入25-30 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，000Xg離心力下離心Imin洗脫DNA，即完成純化。
[0007]上述所述的第一步的4)中將luciferase DNA片段與純化后的pLVX-1RES-ZsGreenl酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接的具體步驟是:
①將50ng純化后的pLVX-1RES-ZsGreenl酶切產(chǎn)物和3倍摩爾量的luciferase DNA片段混合，加蒸餾水至總體積為10 μ? ;
②加入10 μ? 2 X Quick Ligat1n Buffer，混勾；
③加入Iμ? Quick T4 DNA連接酶，混勻；
④在室溫下作用5分鐘后即得連接產(chǎn)物，鏈接產(chǎn)物貯存于-20°C的環(huán)境中。
[0008]上述所述的第一步的5)中抗性刪選的具體步驟是:
①取一管感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，在冰上溶解后加入3μ L連接產(chǎn)物，混勻，冰浴3