克隆篩選，得到pLVX-luciferase-1RES-ZsGreenl質(zhì)粒; 第二步，慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達系統(tǒng)的建立: 將pLVX-luciferase-1RES-ZsGreenl質(zhì)粒與輔助包裝原件載體質(zhì)粒pspax2和pMD2G用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細胞，即得慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達系統(tǒng)； 第三步，穩(wěn)定表達luciferase的胰腺癌細胞系的建立: 將慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達系統(tǒng)加入胰腺癌細胞培養(yǎng)液中，感染細胞，受感染的細胞，luciferase基因可整合至細胞基因組中，形成穩(wěn)定表達luciferase的細胞，以終濃度4 μ g/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達luciferase的細胞，建立穩(wěn)定表達luciferase的胰腺癌細胞系； 第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立: ①將IX 17個穩(wěn)定表達luciferase的胰腺癌細胞系，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為100 μ L，細胞密度為I X 1VlOO μ L，再與100 μ L Matrigel等體積混合，得到細胞懸液，至于冰上備用， ②采用胰島素注射器，將50μ L細胞懸液注射入裸鼠胰腺包膜下，即得裸鼠胰腺原位移植瘤模型； 第五步，炎癥模型的建立: 以濃度為80%的乙醇為溶劑溶解DBTC，配制成3.2mg/mL的母液，在裸鼠胰腺原位移植瘤模型建立后第三天，將母液用等體積PBS稀釋后進行DBTC尾靜脈注射，即得炎癥模型，其中按2mg/kg體重計算DBTC用量； 第六步，具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立: 繼續(xù)飼養(yǎng)裸鼠30天，在裸鼠體內(nèi)即建立具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌模型。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的2)和3)中采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進行純化的步驟相同，具體步驟是: ①在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，計算凝膠重量，該重量作為一個凝膠體積； ②將凝膠放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3個凝膠體積的BufferDE-A,混合均勻后于75°C加熱，間斷混合直至凝膠塊完全熔化； ③再加入0.5個凝膠體積的Buffer DE-B，混合均勻，得到混合液； ④吸取步驟③中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，OOOXg離心力下離心I min，棄濾液； ⑤將制備管置回2mL離心管，加入500 μ L Buffer Wl，在12，000 Xg離心力下離心30 S，棄濾液; ⑥再將制備管置回2mL離心管，加入700 μ L Buffer W2，在12，000 Xg離心力下離心30 S，棄濾液，再加入700 μ L Buffer W2，在12，OOOXg離心力下離心I min，棄濾液; ⑦將制備管置回2mL離心管中，在12，000Xg離心力下離心Imin ； ⑧將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備膜中央加入25-30 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，000Xg離心力下離心Imin洗脫DNA，即完成純化。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的4)中將luciferase DNA片段與純化后的pLVX-1RES-ZsGreenl酶切產(chǎn)物進行連接的具體步驟是: ①將50ng純化后的pLVX-1RES-ZsGreenl酶切產(chǎn)物和3倍摩爾量的luciferase DNA片段混合，加蒸餾水至總體積為10 μ? ; ②加入10 μ? 2 X Quick Ligat1n Buffer，混勾； ③加入Iμ? Quick T4 DNA連接酶，混勻； ④在室溫下作用5分鐘后即得連接產(chǎn)物，鏈接產(chǎn)物貯存于-20°C的環(huán)境中。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的5)中抗性刪選的具體步驟是: ①取一管感受態(tài)大腸桿菌細胞，在冰上溶解后加入3μ L連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min ; ②將管靜置于42°C中水浴90s后，迅速轉(zhuǎn)移至冰中，冰浴l_2min; ③在管中加入900yL LB，在37°C中水浴1min ; ④將管置于搖床中，在37°C、轉(zhuǎn)速210rpm下?lián)u菌45min ； ⑤將100μ L已轉(zhuǎn)化的細胞涂布于氨芐青霉素平板上； ⑥倒置平板，在37°C培養(yǎng)16-20h，即完成抗性篩選。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的6)中陽性克隆篩選的具體步驟是: (I)菌落PCR篩選: 挑取單克隆菌落，置于300 μ L含氨芐青霉素的LB中，在37 °C、轉(zhuǎn)速280 rpm下?lián)u菌6_8h，得到菌液，菌液米用PrimerSTAR HS DNA polymerase進行PCR篩選，得到菌落PCR結(jié)果陽性的克?。? (2)酶切鑒定: 取菌落PCR結(jié)果陽性的克隆，采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，并采用XhoI和XbaI限制性內(nèi)切酶進行酶切，能切出1700bp片段的即為酶切鑒定陽性的克??； (3)測序鑒定: 取酶切鑒定陽性的克隆，進行測序，測序結(jié)果采用Clustalx軟件與luciferase序列進行比對，序列匹配即構(gòu)建成功，即得到pLVX-luciferase-1RES-ZsGreenl質(zhì)粒。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，其特征在于所述(2)中采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒的具體步驟是: ①取1-4mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌落PCR結(jié)果陽性的克隆的菌液，在12，000 X g離心力下離心I min，棄盡上清液； ②加入250μ L Buffer SI懸浮細菌進行沉淀； ③加入250μ L Buffer S2，上下翻轉(zhuǎn)混合4_6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液； ④加350μ L Buffer S3，上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，在12，000 X g離心力下離心10 min ； ⑤吸取步驟④中的離心上清液并轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，OOOXg離心力下離心I min，棄濾液； ⑥將制備管置回離心管，加入500μ L Buffer Wl，在12，000 X g離心力下離心I min,棄濾液； ⑦將制備管置回離心管，加入700μ L Buffer W2，在12，000 X g離心力下離心I min,棄濾液，再加入700 μ L Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液； ⑧將制備管置回2mL離心管中，在12，000 Xg離心力下離心I min; ⑨將制備管移入1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加60-80 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，OOOXg離心力下離心I min，即完成質(zhì)粒的提取。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，其特征在于所述第二步中慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達系統(tǒng)建立的具體步驟是: ①接種293T細胞至匯合度為70-90%時轉(zhuǎn)染，得到細胞培養(yǎng)液； ②使用無血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine3000試劑； ③使用無血清培養(yǎng)基稀釋pLVX-luciferase-1RES-ZsGreenl質(zhì)粒，然后添加P3000試劑，混勻，得到預(yù)混液； ④在已稀釋的Lipofectamine3000試劑中加入等量的預(yù)混液，室溫孵育5min，得到DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物； ⑤將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液中； ⑥轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、48、72h，分別收集富含慢病毒顆粒的上清液，上清液通過超離心濃縮病毒，即得到慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達系統(tǒng)。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立方法，步驟如下：第一步，pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1質(zhì)粒的構(gòu)建；第二步，慢病毒介導(dǎo)的luciferase過表達系統(tǒng)的建立；第三步，穩(wěn)定表達luciferase的胰腺癌細胞系的建立；第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立；第五步，炎癥模型的建立；第六步，具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌動物模型的建立：繼續(xù)飼養(yǎng)裸鼠30天，在裸鼠體內(nèi)即建立具有炎癥基礎(chǔ)的胰腺癌模型。通過以上步驟建立得到的胰腺癌動物模型，可以通過使用的Luciferase，催化底物發(fā)光，被相應(yīng)儀器設(shè)備檢測到后就可以評估腫瘤的大小。
【IPC分類】A01K67/027, C12N5/10, C12N15/867
【公開號】CN105039410
【申請?zhí)枴緾N201510528973
【發(fā)明人】李偉, 吳夢瑤, 陶敏, 龔斐然
【申請人】蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月26日