一種青霉菌生產(chǎn)(s)-氯苯二氯乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到青霉菌細(xì)胞生物催化制備手性醫(yī)藥中 間體（S)-l_(3,4-氯苯基）二氯乙醇的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性⑶-1-(3, 4_氯苯基）二氯乙醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品和其 他特殊材料的重要中間體。生物催化不對(duì)稱(chēng)反應(yīng)具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu) 點(diǎn)，作為綠色高效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來(lái)越多地應(yīng)用于生產(chǎn)一些高附加值的 手性化合物。生物催化制備手性（S)-l_(3, 4-氯苯基）二氯乙醇具有很好的應(yīng)用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)，是可持續(xù) 發(fā)展過(guò)程中替代和拓展傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。其中手性拆分和不對(duì)稱(chēng)合成是生物 催化最具吸引力的應(yīng)用領(lǐng)域。在作為生物催化劑的六大類(lèi)酶中，水解酶能夠催化動(dòng)力學(xué)拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來(lái)，氧化還原 酶在工業(yè)上的應(yīng)用得到了迅速增長(zhǎng)。目前，采用水解酶動(dòng)力學(xué)拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學(xué)活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004] 生物還原法相對(duì)于動(dòng)力學(xué)拆分法而言，最大的優(yōu)勢(shì)在于理論收率可達(dá)100%，原子 經(jīng)濟(jì)性好。然而生物還原反應(yīng)需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應(yīng)用。由于 輔酶依賴(lài)性的緣故，生物還原反應(yīng)中多釆用整細(xì)胞作為催化劑，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)輔酶循環(huán)再生的 同時(shí)免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)_l_(3, 4_氯苯基）二氯乙醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品的重要手性 砌塊，?，F(xiàn)有的方法普遍存在轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴(yán)重缺 陷，難于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細(xì)胞催化制備（S)-l_(3, 4-氯苯基）二氯乙 醇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用青霉菌細(xì)胞催化制備（S)-1-(3, 4-氯苯基）二氯乙醇，反應(yīng)式如下：
2,3'，4'三氯苯乙酮（1)經(jīng)青霉菌催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物（S)-l_(3,4-氯苯基）二氯乙 醇（2)。有多種微生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定采用青霉菌作為催化 劑，因?yàn)槠浯呋磻?yīng)的效果最好，反應(yīng)收率、對(duì)映體過(guò)量率（ee%)均很高。
[0007] 許多青霉菌都可以進(jìn)行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，本 發(fā)明選用青霉菌菌株為ATCC 26797，其催化反應(yīng)效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD (P)H依賴(lài)型，而細(xì)胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)時(shí)，為促進(jìn)輔酶再生，提高反應(yīng)效率，在反應(yīng)體系中 還添加輔助底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系。常用的輔助底物種類(lèi)較多，不同細(xì)胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)確定的輔助底物為：葡萄糖20-23g/L、木糖20-24g/L、蔗 糖25-28g/L、異丙醇5-6%V/V (體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，麥芽浸 膏25-30 g，硫酸銨0. 5-0. 7g/L;配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡 萄糖18-22 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀 1. 8-2. 3g/L，碳酸鈣 0.7 g/L，硫酸亞鐵 0.18 g/L，硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.0。
[0012] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 青霉菌細(xì)胞制備。青霉菌經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng) 液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至23-24°C，將青霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為 10-11%，通氣比為0.9-1￥/(￥分鐘），23-24°(：培養(yǎng)35-40小時(shí)，用過(guò)濾式離心機(jī)離心得到 濕青霉菌細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0014] 生物催化轉(zhuǎn)化。底部通氣攪拌反應(yīng)罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為5. 9,加入底 物2, 3'，4'三氯苯乙酮，使底物濃度為80-90 g/L。其他成份：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含 量為12-15g/L，單硬脂酸甘油酯含量為17-18g/L，葡萄糖20-23g/L、木糖20-24g/L、蔗糖 25-28g/L、異丙醇5-6%V/V (體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至24-25°C時(shí)，加入濕 青霉菌細(xì)胞使其濃度為90-94g/L，通氣比為0. 16-0. 18V/ (V分鐘），進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反 應(yīng)時(shí)間為70-74小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到 產(chǎn)物（S)-l_(3, 4-氯苯基）二氯乙醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98-99%，產(chǎn)品收率96-97%，對(duì)映體過(guò) 量率 98. 5-99%。
[0015] 本發(fā)明所開(kāi)展工作包括菌株選擇、催化反應(yīng)條件優(yōu)化(反應(yīng)溫度、通氣量、pH)、反 應(yīng)介質(zhì)選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、輔助底物組合、表面活性劑種類(lèi)及濃度等。
[0016] 實(shí)施例1 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母提取物10 g/L，葡 萄糖20 g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L;配制固體培 養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0017] 玉米衆(zhòng)（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18-22 g/ L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L，碳 酸鈣 0.7 g/L，硫酸亞鐵 0? 18 g/L，硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.0。
[0018] 培養(yǎng)液成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡 萄糖18-22 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀 1. 8-2. 3g/L，碳酸鈣 0.7 g/L，硫酸亞鐵 0.18 g/L，硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.0。
[0019] 濕青霉菌細(xì)胞制備過(guò)程如下：青霉菌ATCC 26797經(jīng)斜面、搖瓶培養(yǎng)，得到種子 液。1L發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至23°C，將青 霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為接種比例為10-11%，通氣比為0. 9-1V/ (V分鐘)， 23°C培養(yǎng)35-40小時(shí)，用過(guò)濾式離心機(jī)離心得到濕青霉菌細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0020] 生物催化轉(zhuǎn)化：0.5L底部通氣攪拌反應(yīng)器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為5.9,加入 底物2,3'，4'三氯苯乙酮，使其濃度為80g/L，玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為12g/L，單硬脂 酸甘油酯含量為17_18g/L，葡萄糖20-23g/L、木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、異丙醇5-6%V/ V (體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至24-25°C時(shí)，加入濕青霉菌細(xì)胞使其濃度為 90-94g/L，通氣比為0. 16-0. 18VAV分鐘)，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為70-74小時(shí)；反 應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（S)-1-(3, 4-氯苯 基）二氯乙醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99%，產(chǎn)品收率97%，對(duì)映體過(guò)量率98. 5%。
[0021] 實(shí)施例2 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母提取物10 g/L，葡 萄糖20 g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2.