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      一種假絲酵母生產(s)-氟苯乙醇的方法

      文檔序號:9320637閱讀:402來源:國知局
      一種假絲酵母生產(s)-氟苯乙醇的方法
      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術領域,特別涉及到近平滑假絲酵母細胞生物催化制備 手性醫(yī)藥中間體(S)-2-氟苯乙醇的技術。
      【背景技術】
      [0002] 手性(S)-2-氟苯乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品和其他特殊材料的重 要中間體。生物催化不對稱反應具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點,作為綠色高效 制備手性化合物的優(yōu)先途徑,被越來越多地應用于生產一些高附加值的手性化合物。生物 催化制備手性(S) -2-氟苯乙醇具有很好的應用前景。
      [0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點,是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中,水解酶能夠催化動力學拆 分外消旋體得到手性產品,在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來,氧化還原 酶在工業(yè)上的應用得到了迅速增長。目前,采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學活性手性化合物的比例為4:2:1。
      [0004] 生物還原法相對于動力學拆分法而言,最大的優(yōu)勢在于理論收率可達100%,原子 經濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與,一定程度上限制了其應用。由于 輔酶依賴性的緣故,生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑,實現(xiàn)體內輔酶循環(huán)再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
      [0005] (S)-2-氟苯乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品的重要手性砌塊,?,F(xiàn)有的 方法普遍存在轉化率低、反應時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴重缺陷,難于進行工 業(yè)化生產。本發(fā)明將采用生物細胞催化制備(S)-2-氟苯乙醇。

      【發(fā)明內容】

      [0006] 本發(fā)明采用近平滑假絲酵母細胞催化制備(S)-2-氟苯乙醇,反應式如下:
      底物2-氟苯乙酮(1)經近平滑假絲酵母催化反應,得到產物(S)-2_氟苯乙醇(2)。 有多種微生物可以催化此反應,經過大量實驗篩選,最終確定采用近平滑假絲酵母作為催 化劑,因為其催化反應的效果最好,反應收率、對映體過量率(ee%)均很高。
      [0007] 許多近平滑假絲酵母都可以進行生物催化此反應,然而,其效果不同,相差很大, 經實驗,本發(fā)明選用近平滑假絲酵母菌株為ATCC 96142,其催化反應效果最佳。
      [0008] 由于絕大多數氧化還原酶是輔酶NAD (P)H依賴型,而細胞本身所含有的輔酶量 可能較少,因此,進行氧化還原反應時,為促進輔酶再生,提高反應效率,在反應體系中 還添加輔助底物構成轉化體系。常用的輔助底物種類較多,不同細胞所需的輔助底物不同, 效果差別很大,采用幾種輔助底物組合,可以取得較好效果,需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經過大量實驗確定的輔助底物為:葡萄糖20-23g/L、麥芽糖30-36g/L、 異丙醇5-6%V/V (體積濃度)。
      [0009] 由于底物溶解度較低,所以,加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
      [0010] 培養(yǎng)介質: 1、種子培養(yǎng)基成份為:酵母提取物10 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,pH7. 1; 配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
      [0011] 2、培養(yǎng)液成份:葡萄糖37-44 g/L,木糖7-8g/L,玉米胚芽粉10-12 g/L,酵母提 取物 4-5 g/L,(NH4) 2H P04 12-15 g/L,KH2P0 4 6. 5-7. 5 g/L. MgS04 ? 7H20 0? 7-0. 8 g/L,NaCl 0.08-0.1 g/L; pH7.1。
      [0012] 2、固體培養(yǎng)基成份:在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
      [0013] 酵母細胞制備。近平滑假絲酵母經斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā)酵罐加 入培養(yǎng)液,121°C高壓滅菌30分鐘,冷卻至27-28°C,將近平滑假絲酵母種子液接種至發(fā)酵 罐,接種比例為6-6. 5%,通氣比為0. 5-1VAV分鐘),27-28°C培養(yǎng)42-45小時,用過濾式離 心機離心得到濕酵母細胞,用作生物催化反應催化劑。
      [0014] 生物催化轉化 底部通氣攪拌反應罐中加入磷酸鹽緩沖液,pH為7. 4,加入底物2-氟苯乙酮,使底 物濃度為80-90 g/L。其他成份:麥芽浸膏22-26 g,支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚 15-16g/L,葡萄糖20-23g/L、麥芽糖30-36g/L、異丙醇5-6%V/V (體積濃度),121°C高壓滅菌 30分鐘;冷卻至27-28°C時,加入濕酵母細胞使?jié)舛葹?8-82g/L,通氣比為0. 15-0. 16V/(V 分鐘),即每分鐘通氣量為0. 15-0. 16倍反應液體積,進行生物催化反應,反應時間為59-64 小時;反應結束后,濾出細胞,用乙酸乙酯萃取反應液,蒸出乙酸乙酯,得到產物(S)-2-氟 苯乙醇,反應轉化率98-99 %,產品收率96-97 %,對映體過量率98. 5-99 %。
      [0015] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應條件優(yōu)化(反應溫度、通氣量、pH)、反 應介質選擇和濃度優(yōu)化,包括底物濃度、麥芽浸膏含量、輔助底物組合、表面活性劑種類及 濃度等。
      [0016] 實施例1 種子培養(yǎng)基成份為:酵母提取物10 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,pH7. 1;配制 固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
      [0017] 培養(yǎng)液成份為:葡萄糖37 g/L,木糖78g/L,玉米胚芽粉10 g/L,酵母提取物4 g/L, (NH4) 2H P04 12 g/L, KH2P0 4 6.5 g/L. MgS04 . 7H20 0.7 g/L, NaCl 0.08 g/L; pH7. l〇
      [0018] 濕酵母細胞制備過程如下:近平滑假絲酵母ATCC 96142經斜面、搖瓶培養(yǎng),得到 種子液。1L發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液,121°C高壓滅菌30分鐘,冷卻至27°C,將近平滑假絲酵母 種子液接種至發(fā)酵罐,接種比例為6%,通氣比為0.5VAV分鐘),27°C培養(yǎng)42小時,用過濾 式離心機離心得到濕酵母細胞,用作生物催化反應催化劑。
      [0019] 生物催化轉化:0. 5L底部通氣攪拌反應器中加入磷酸鹽緩沖液,pH為7. 4,加入 底物2-氟苯乙酮,使?jié)舛葹?0 g/L,麥芽浸膏22 g,支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚 16g/L,葡萄糖22g/L、麥芽糖35g/L、異丙醇5%V/V (體積濃度),121°C高壓滅菌30分鐘;冷 卻至27°C時,加入濕酵母細胞使?jié)舛葹?8g/L,通氣比為0. 15V/ (V分鐘),進行生物催化反 應,反應時間為59小時;反應結束后,濾出細胞,用乙酸乙酯萃取反應液,蒸出乙酸乙酯,得 到產物(S) -2-氟苯乙醇,反應轉化率99%,產品收率97%,對映體過量率98. 5%。
      [0020] 實施例2 種子培養(yǎng)基成份為:酵母提取物10 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,pH7. 1
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