包衣菌體在有機介質(zhì)中生物合成共軛亞油酸異構(gòu)體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一組十八碳共軛二稀酸的統(tǒng)稱，共軛雙鍵有4種位置異構(gòu)(8，10; 9, 11; 10, 12; 11，13)和4種幾何異構(gòu)(cis，cis;cis, trans] trans, cis\ trans, trans),共有多達 16 種異構(gòu)體，如:c9, ill-CLA 和ilO, C12-CLA異構(gòu)體等。研究發(fā)現(xiàn)CLA具有抗癌、預(yù)防動脈粥樣硬化、增強機體免疫力、抗糖尿病等生理功能，且越來越多的研究表明其生理活性具有異構(gòu)體特異性，現(xiàn)在普遍認(rèn)為d，1-CLA異構(gòu)體具有抗癌和預(yù)防動脈粥樣硬化的作用。在自然界中，CLA主要存在于反芻動物的奶和肉中的脂肪中，主要由說ill-CLA和少量份’ ill-CLA, ilO，cll-CLA等異構(gòu)體構(gòu)成，但其含量通常都小于10mg/g脂肪，無法滿足以保健和醫(yī)療為目的的開發(fā)應(yīng)用。
[0003]為實現(xiàn)CLA異構(gòu)體的大量制備，人們已對微生物發(fā)酵制備CLA進行了較多研究。目前，微生物發(fā)酵均在水溶液中進行，由于所加的發(fā)酵底物一亞油酸是脂溶性物質(zhì)，因此亞油酸加入發(fā)酵液前需經(jīng)乳化處理，且添加量受到限制，從發(fā)酵液中獲得CLA產(chǎn)物需經(jīng)有機溶劑萃取，整個生產(chǎn)工藝存在發(fā)酵周期長、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低的缺點。發(fā)明專利CN201110105610提出了一種植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的方法，底物添加量為25mg/mL，發(fā)酵時間長達120h，CLA的產(chǎn)量只有1.02mg/mL，底物的轉(zhuǎn)化率只有4%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種包衣菌體在有機介質(zhì)中生物合成共軛亞油酸異構(gòu)體的方法，顯著縮短合成時間、提高產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率、降低生產(chǎn)成本。
[0005]本發(fā)明包括以下步驟。
[0006](I)菌體的透性化處理:收集處于對數(shù)生長期的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei )CGMCC 1.574菌體，按每克濕菌體重懸于5mL透性化處理液中計，將濕菌體重懸于透性化處理液中(所述的透性化處理液為體積百分比0.5-3.0%的曲拉通X-100，5-50 μ M的亞油酸，20-200mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液)，重懸菌體經(jīng)37°C處理20min，離心收集透性化菌體。
[0007](2)菌體包衣處理:透性化菌體用50mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液洗滌后，離心收集菌體，按每克濕菌體重懸于20mL50mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液中計，將透性化濕菌體重懸于磷酸鹽緩沖液中，加入菌懸液體積百分比0.5-2.0%的吐溫-20混合均勻，于4-40°C處理2-6h，離心收集菌體，將菌體冷凍干燥后得到包衣菌體。
[0008](3)有機介質(zhì)中生物合成:按每克凍干包衣菌體加入到600mL正己烷中計，將包衣菌體加入到正己烷中，攪拌均勻，加入正己烷體積百分比0.1-0.3%的亞油酸，在4-40°C下反應(yīng)l-12h。
[0009](4)產(chǎn)物收集:離心分離包衣菌體，將正己烷溶液進行減壓蒸餾，回收正己烷，產(chǎn)物為c9, ill-共軛亞油酸異構(gòu)體。
[0010]本發(fā)明所述的步驟(I)中透性化處理液優(yōu)選為體積百分比1.0-2.0%的曲拉通X-100，15-35 μ M的亞油酸，30-100mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液。
[0011]本發(fā)明所述的步驟(2)中吐溫-20的加入量優(yōu)選為菌懸液體積百分比的0.75-1.5%。
[0012]本發(fā)明所述的步驟(2)中處理溫度優(yōu)選為4_25°C。
[0013]本發(fā)明所述的步驟(2)中處理時間優(yōu)選為3_5h。
[0014]本發(fā)明所述的步驟(3)中優(yōu)選加入正己烷體積百分比0.125-0.25%的亞油酸，在15-30 °C 下反應(yīng) 2-6h。
[0015]本發(fā)明所述的步驟(4)中包衣菌體可重復(fù)用于有機介質(zhì)中生物合成d，ill-共軛亞油酸異構(gòu)體。
[0016]本發(fā)明所用的干酪乳桿菌(Zac1AaciWiAs casei) CGMCC 1.574，系中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏菌株，編號為1.574，該菌株能產(chǎn)生特異性的亞油酸異構(gòu)酶，通過生物異構(gòu)化可將亞油酸轉(zhuǎn)化成d，ill-CLA異構(gòu)體。目前，還沒有分離到有確切催化活性的亞油酸異構(gòu)酶純品。因此，該異構(gòu)化反應(yīng)可能是由多酶體系共同催化完成。
[0017]通過該包衣菌體在有機介質(zhì)中生物合成方法，在優(yōu)化條件下，含體積百分比0.15%亞油酸的正己烷溶液反應(yīng)后所合成d，ill-CLA異構(gòu)體的含量為體積百分比0.1395%，亞油酸的轉(zhuǎn)化率為93.0%。本發(fā)明所述的步驟(4)中包衣菌體可重復(fù)用于步驟(3)的有機介質(zhì)中生物合成d，ill-CLA異構(gòu)體，包衣菌體重復(fù)使用五次后，其催化活性仍大于90%。
[0018]針對現(xiàn)有微生物發(fā)酵合成CLA均在水溶液中進行，整個生產(chǎn)工藝存在發(fā)酵周期長，從發(fā)酵液中提取CLA產(chǎn)物困難，菌體不能重復(fù)使用，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低等諸多缺點。本發(fā)明提出了通過微生物菌體在有機介質(zhì)中將亞油酸催化合成d，ill-CLA的新方法。該方法首先通過曲拉通X-100處理干酪乳桿菌CGMCC 1.574，在保持菌體完整性的同時，提高菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，一方面可以確保在后續(xù)包衣處理時細(xì)胞內(nèi)的亞油酸異構(gòu)酶表面能形成完整包衣層，另一方面可以提高反應(yīng)底物亞油酸和產(chǎn)物CLA進出菌體的速率，減少高濃度底物和產(chǎn)物對催化反應(yīng)的抑制作用，大大縮短反應(yīng)時間。
[0019]本發(fā)明在透性化處理菌體時，加入5-50 μM的亞油酸，亞油酸可以和菌體中亞油酸異構(gòu)酶催化活性中心結(jié)合，在菌體包衣處理時，能在酶的催化活性中心形成分子印跡，使菌體在冷凍干燥后酶的催化活性中心構(gòu)象不變，能在有機介質(zhì)中保持較高的催化活性。同時，本發(fā)明結(jié)合在菌體包衣處理過程中選用合適的磷酸鹽緩沖液、吐溫-20濃度和包衣溫度、時間，使所得包衣菌體在有機介質(zhì)中仍具有較高的催化能力。包衣后菌體中酶的熱穩(wěn)定性提高，每批次反應(yīng)時間僅需4h，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)水溶液中批次發(fā)酵所需的數(shù)天時間。
[0020]本發(fā)明所得包衣菌體在正己烷中有較高催化活性，只需離心分離包衣菌體，將正己烷溶液進行減壓蒸餾，回收正己烷，即可得到產(chǎn)物d，ill-CLA。離心所得包衣菌體可多次重復(fù)用于有機介質(zhì)中生物合成d，ill-CLA異構(gòu)體，顯著縮短了生產(chǎn)時間，提高了產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。此外，正己烷是食用油脂工業(yè)常用的有機溶劑，這也保證了本發(fā)明所得c9, il 1-CLA的使用安全性。
[0021]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點。
[0022]本發(fā)明直接對菌體進行包衣處理，作為固定化酶用于催化反應(yīng)，一方面減少了酶分離純化的成本，避免了酶在提取時活性的損失；另一方面可以將多酶體系包在一起，使整個反應(yīng)過程得以順利進行；再者包衣菌體顆粒大于包衣酶，易于從反應(yīng)溶液中分離出來，且過濾阻力較小，因此，包衣菌體更加適合用于連續(xù)反應(yīng)的柱式反應(yīng)器。
[0023]本發(fā)明通過包衣菌體在有機介質(zhì)中進行催化反應(yīng)，避免了在傳統(tǒng)水溶液反應(yīng)體系中底物亞油酸溶解度低和產(chǎn)物CLA提取困難的問題。包衣菌體中酶的熱穩(wěn)定性提高，每批次反應(yīng)時間僅需4h，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)水溶液中發(fā)酵所需的數(shù)天時間。包衣菌體可重復(fù)使用多次，顯著提高產(chǎn)品產(chǎn)量，且無環(huán)境污染，可顯著降低生產(chǎn)成本；而傳統(tǒng)水溶液體系發(fā)酵液中的菌體只能使用一次，生產(chǎn)成本高，且發(fā)酵廢液處理費用高，易污染環(huán)境。
【具體實施方式】
[0024]本發(fā)明通過以下實施例作進一步地說明。
[0025]實施例1。
[0026]將活化的干酪乳桿菌QLactobacillus casei) CGMCC 1.574菌種接種到MRS培養(yǎng)基中，于30°C下培養(yǎng)20h，5000g離心1min收集菌體，將10克濕菌體重懸于50mL含體積百分比1.5%的曲拉通Χ-100、25 μΜ的亞油酸和50mM磷酸鹽緩沖液(pH5.8)的透性化處理液中，37°C水浴處理20min，5000g離心1min得到透性化菌體。
[0027]透性化菌體