雞mtDNA D-loop區(qū)全序列擴增及測序方法和專用引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種雞mtDNA D-loop全序列擴增及其 測序方法。
【背景技術】
[0002] 動物遺傳資源多樣性能夠為品種改良提供素材，并且能夠很好適應環(huán)境的變化。 我國有豐富家禽地方品種資源，研究和評估我國家禽地方品種的遺傳多樣性，制定合理的 利用和保護措施對我國畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。研究動物遺傳多樣性的方法主 要有微衛(wèi)星和線粒體DNA等，兩種方法各有優(yōu)缺點，線粒體DNA更容易操作。畜（禽）品種 大都受到外來公畜（禽）雜交改良的影響，群體數量減少甚至消失，給研究品種起源和多樣 性帶來很大困難。線粒體DNA在遺傳過程中，遺傳物質通過卵細胞質傳遞，較少發(fā)生DNA重 組，其野生祖先的線粒體DNA類型一般能得以保持。這種遺傳方式，一個個體就能代表一個 母性集團，因此只需少量個體樣本便能反映一個群體的遺傳結構。研究者可以從復雜的遺 傳背景中分辨不連續(xù)的母系血統(tǒng)，即使經過幾千年的雜交繁育，系統(tǒng)關系依然明晰。
[0003] 雞線粒體基因組一般在16785bp左右，為閉合環(huán)狀雙鏈結構，能夠自主復制和轉 錄。包括37個基因的編碼編碼區(qū)（13個蛋白質編碼基因、2個核糖體RNA基因、22個轉運 RNA基因）和1個控制區(qū)（D-loop)。D-loop區(qū)為mtDNA上最重要的非編碼區(qū)，進化速率較 編碼區(qū)更快，是適合親緣關系較近的群體進行遺傳分化研究的理想分子標記。D-l 〇〇p區(qū)部 分或者全部序列已經廣泛地應用于動物類群的遺傳多樣和系統(tǒng)進化研究中。國內外雖然已 經有人用D-loop區(qū)高變區(qū)進行雞遺傳多樣性和親緣進化的研究，但是全序列包含的遺傳 信息更為豐富，目前還沒有運用D-loop區(qū)全序列對我國家禽地方品種進行系統(tǒng)的研究，因 此建立mtDNA D-loop區(qū)全序列擴增和測序方法是十分必要的。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提出一種雞mtDNA D-loop區(qū)全序列的擴增及測序方法和專用 引物，本發(fā)明速度快、成本低、易于掌握，能夠有效檢測出雞的mtDNA D-loop區(qū)全序列。
[0005] 本發(fā)明提供了一種雞mtDNA D-loop區(qū)全序列擴增及測序用引物，包括PCR引物 和測序引物，所述PCR引物的上游引物：5' -AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，PCR引物的下游引 物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'；
[0006]所述測序引物：5' -GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種雞mtDNA D-loop區(qū)全序列擴增及測序方法，包括以下步驟：
[0008] (1)提取雞羽毛中的DNA，并檢測質量。
[0009] (2)根據紅色原雞mtDNA D-loop區(qū)在mtDNA全基因組序列上的相對位置，在mtDNA D-loop區(qū)上下游保守區(qū)域設計一對PCR引物，PCR引物引物序列為：
[0010] Forward prime(SEQ ID NO. 1):5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3,
[0011] Reverse primer(SEQ ID NO. 2):5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'
[0012] (3) PCR產物測序與序列拼接
[0013] 通過PCR反應，獲得目的片段，純化后送測序公司測序，由于mtDNA D-l〇〇p區(qū)下游 結構復雜，反向引物無法測出，根據正向引物已測出的mtDNA D-l〇〇p區(qū)序列設計一條測序 引物，進行引物步移（Primer walking)測序，然后將正向引物和步移引物測得兩條序列進 行拼接，獲得mtDNA D-loop區(qū)全序列。
[0014] 測序引物 Walking primer(SEQ ID N0. 3)為 5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。
[0015] 步驟1中雞羽毛中DNA的提取步驟為：羽毛樣采集雛雞或者成雞換羽后剛長出的 羽毛，一般為2-3根，用剪刀剪掉羽根上部的絨羽，在干凈的PE手套上剪碎后，放入2mL離 心管中，每個樣品加入裂解液1000 y L及蛋白酶K 40 y L搖勻，放搖床內59°C水浴消化。消 化充分后，加700-800uL飽和酚，搖勻10min后以轉速lOOOOrpm離心5min。吸取上清液放 入2mL離心管中，加1000uL飽和酸，搖勾5min后以轉速lOOOOrpm離心5min。吸取上清液 放入2mL離心管中，加氯仿1000uL，搖勾5min后以轉速lOOOOrpm離心5min。吸取上清液放 入2mL離心管中，加無水乙醇沉淀出DNA團塊，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA團塊用70%的 酒精洗一遍，以轉速l〇〇〇〇rpm離心10min。倒掉乙醇，留下DNA，涼干（lh)，加滅菌水100uL 溶解，放_2〇°C冰箱保存。
[0016] 步驟 3 中 PCR 反應體系為：PCR Mix 25 1^，1〇4111〇1/1引物各1.5 1^，模板2 1^， 滅菌水20 y L。
[0017] 步驟 3 中 PCR 反應程序為：95°C 5min，（95°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)30 循環(huán)， 72°C 4min〇
[0018] 步驟3中所述mtDNA D-loop區(qū)拼接方法為將測序得到的序列經DNAStar 5. 02軟 件的SeqMan程序拼接。拼接序列與GenBank中紅色原雞參考序列NC_007235進行比對，剪 掉引物及多余的序列。
[0019] 上述的方法，所述PCR擴增特異性條帶為1635bp，包含mtDNA D-loop區(qū)全序列及 上下游部分序列，其核苷酸序列為：（大寫字母表示上游和下游序列，黑色下劃線表示上下 游引物位置，陰影部分表示步移引物位置）：
[0020]

[0045] 。
[0046] 與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0047] 1、本發(fā)明的檢測方法具有速度快、成本低、易掌握等優(yōu)點，能夠有效檢測出雞的 mtDNA D-l〇〇p區(qū)全序列，從而為雞分子遺傳學及分子系統(tǒng)進化學研究提供有效的研究平 臺；
[0048] 2、提供了一種節(jié)約成本、簡便易行的擴增雞mtDNA D-loop區(qū)全序列的方法。本發(fā) 明提供的雞mtDNA D-l〇〇p區(qū)全序列可應用于雞遺傳資源多樣性評估、母系起源、系統(tǒng)進化 分析和種質資源鑒定與保護等多個領域；
[0049] 3、本發(fā)明采用羽毛采集，替代傳統(tǒng)的血液采樣，減小了對實驗動物的傷害，并且能 獲得高質量的DNA模板。
【具體實施方式】
[0050] -種雞mtDNA D-l〇〇p區(qū)全序列擴增及測序用引物，包括PCR引物和測序引物。
[0051] PCR 引物的上游引物：5' -AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，
[0052] PCR 引物的下游引物：5' -CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'。
[0053]測序引物：5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。
[0054] -種雞mtDNA D-l〇〇p區(qū)全序列擴增及測序方法，包括以下步驟：
[0055] (1)提取雞羽毛中的DNA，并檢測質量；
[0056] (2)在雞mtDNA D-loop區(qū)上下游保守區(qū)域設計一對PCR引物，通過PCR反應 擴增包含Cytb基因的片段，經瓊脂糖電泳條帶單一、亮度高；所述PCR引物的上游引物 為：5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，PCR 引物的下游引物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3' ；
[0057] (3)設計測序引物對所述PCR產物進行測序，所述測序引物為： 5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'；
[0058] (4)對測序獲得序列進行拼接，并剪掉上下游多余的序列，獲得雞mtDNA D-loop 區(qū)全序列，mtDNA D-loop區(qū)全序列全長為1231_1232bp。
[0059] 用于擴增雞mtDNA D-loop區(qū)全序列的PCR反應體系為：PCR Mix 25 yL，10 y mol/ LPCR引物的上、下游引物各1. 5 y L，模板2 y L，滅菌水20 y L。
[0060] 用于擴增雞mtDNA D-loop區(qū)全序列的PCR反應程序為：95°C 5min ;95°C 30s， 55°〇3〇8,721€6〇8,30個循環(huán)；721€4111111。
[0061] 羽毛樣采集雛雞或者成雞換羽后剛長出的羽毛2-3根，剪掉羽根上部的絨羽，剪 碎后的羽毛放入2mL離心管中，每個羽毛樣品加入裂解液1000 y L及蛋白酶K 40 y L搖勻， 放搖床內59 °C水浴消化；
[0062] 消化充分后，加700-800uL飽和酚，搖勻10min后以轉速lOOOOrpm離心5min ;
[0063] 吸取上清液放入2mL離心管中，加1000uL飽和酸，搖勾5min后以轉速lOOOOrpm 離心5min ;
[0064] 吸取上清液放入2mL離心管中，加氯仿1000uL，搖勻5min后以轉速lOOOOrpm離心 5min ；
[0065] 吸取上清液放入2mL離心管中，加無水乙醇沉淀出DNA團塊，留下DNA倒掉乙醇， 再把DNA團塊用70%的酒精洗一遍，以轉速lOOOOrpm離心10min ;倒掉乙醇，留下DNA，涼 干lh，加滅菌水100uL溶解，于-20°C保存。
[0066] mtDNA D-loop拼接方法為：將測序得到的序列用DNAStar 5. 02軟件的SeqMan程 序拼接，拼接序列與GenBank中紅色原雞參考序列NC_007235進行比對，剪掉引物及多余的 序列。
[0067] 實施例1藏雞系統(tǒng)進化及遺傳多樣性的研究
[0068] 1.1DNA樣本制備
[0069] 采集30只藏雞頸部換羽后剛長出的羽毛，公母各半，隨機取樣。用剪刀剪掉羽根 上部的絨羽，在干凈的PE手套上剪碎后，放入2mL離心管中，每個樣品加入裂解液1000 y L 及蛋白酶K 40 y L搖勻，放搖床內59°C水浴消化。消化充分后，加700-800uL飽和酚，搖勻 10min后以轉速lOOOOrpm離心5min。吸取上清液放入2mL離心管中，加1000uL飽和酚，搖 勾5min后以轉速lOOOOrpm離心5min。吸取上清液放入2mL離心管中，加氯仿1000uL，搖勾 5min后以轉速lOOOOrpm離心5min。吸取上清液放入2mL離心管中，加無水乙醇沉淀出DNA 團塊，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA團塊用70 %的酒精洗一遍，以轉速lOOOOrpm離10min。 倒掉乙醇，留下DNA，涼干（lh)，加滅菌水100uL溶解，放-20°C冰箱保存。
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