一種中東呼吸綜合征冠狀病毒ORF1a2基因檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物診斷試劑，涉及一種中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2 (MERS-CoV)基因檢測(cè)試劑盒，是一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸篩查方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冠狀病毒是一大類能導(dǎo)致人類疾病的病毒，其臨床表現(xiàn)涵蓋了從普通感冒到嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)的一個(gè)很大的范圍。該類病毒也能在許多種動(dòng)物中引起疾病。2012年底，在中東居民身上發(fā)現(xiàn)了一種新的冠狀病毒，這種冠狀病毒以往從未在人類中發(fā)現(xiàn)過(guò)。該病毒被命名為中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少50多例實(shí)驗(yàn)室確診的人類感染病例。目前，所有感染MERS-CoV的病例都和中東地區(qū)有直接或間接的聯(lián)系，但是在其他國(guó)家近期前往中東旅行的人群中已發(fā)現(xiàn)局部的非持續(xù)的人際傳播發(fā)生。所有MERS-CoV感染病例主要表現(xiàn)為呼吸道疾病，也有一些后續(xù)并發(fā)癥報(bào)道，如急性腎功能衰竭，多器官功能衰竭，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和消耗性凝血病等。此外，許多病例出現(xiàn)胃腸道癥狀，如腹瀉。超過(guò)一半的病例死亡。大多數(shù)病例至少存在一種合并的疾病，但許多病例既往身體健康。很小一部分病例合并感染有其他病原體，如流感病毒，副流感病毒，單純皰疹病毒和肺炎球菌等。截至2013年6月6日，實(shí)驗(yàn)室確診病例的平均年齡為56歲(范圍2 - 94歲)，且多數(shù)是男性(72%)。MERS-CoV被認(rèn)為是一種動(dòng)物病毒，偶爾感染人類并導(dǎo)致有限的人際傳播。該病毒已被證明在過(guò)去通常用于診斷性病毒培養(yǎng)的細(xì)胞中生長(zhǎng)良好。
[0003]目前基于核酸的檢測(cè)方法是目前最普遍、最準(zhǔn)確的基因檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)方法主要包括PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)和基于分子雜交的基因芯片技術(shù)。目前仍以PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，其常用的技術(shù)方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、熒光定量PCR等方法。普通定性PCR方法檢測(cè)效率低，尤其檢測(cè)多基因?qū)ο髸r(shí)更加費(fèi)時(shí)費(fèi)力；巢式PCR雖然提高了檢測(cè)的靈敏度，但同樣存在檢測(cè)效率的問(wèn)題；多重PCR方法可以在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，但常規(guī)的電泳檢測(cè)結(jié)果很難判斷，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果；熒光定量PCR方法靈敏度高，但其成本高，并且需要特殊檢測(cè)儀器?；蛐酒彩浅Ｓ玫霓D(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)，目前一般采用玻璃片作為固相支持物，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要相應(yīng)的點(diǎn)樣儀和芯片識(shí)讀儀，同樣成本較高。
[0004]2000年日本學(xué)者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開(kāi)了一種新的基因診斷技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(Loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)。其特征是針對(duì)靶基因的8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒溫條件(65°C)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，短時(shí)間擴(kuò)增效率達(dá)到19-1Ow個(gè)拷貝。直接靠擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度或顯色反應(yīng)進(jìn)行判斷是否發(fā)生反應(yīng)。該方法不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過(guò)程，LAMP法具有高特異性、高效性、快速廉價(jià)(不需要特定的貴重檢測(cè)設(shè)備，至于要簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的恒溫箱)、易檢測(cè)(直接進(jìn)行目測(cè)判斷)等特點(diǎn)。
[0005]通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)可以達(dá)到以下目的:一是檢測(cè)能力進(jìn)一步提高，LAMP檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)限高于涂片法100-200倍，這樣就有利的解決了傳統(tǒng)的抗酸染色陽(yáng)性檢出率較低的問(wèn)題(有文獻(xiàn)表明30%左右)；二是由于經(jīng)典聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備要求較高(如PCR擴(kuò)增儀，瓊脂凝膠電泳系統(tǒng)等)、技術(shù)較為復(fù)雜，而LAMP檢測(cè)技術(shù)具有儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單(只需要簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的恒溫箱)、檢測(cè)時(shí)間短(0.5-1.0小時(shí))、特異性高(針對(duì)8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6種特異引物)等特點(diǎn)，因此，該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏和特異，將具有非常好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸篩查方法，為了克服現(xiàn)有技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力成本高的缺陷，提供一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏和特異的中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2基因檢測(cè)試劑盒。
[0007]本發(fā)明這樣實(shí)現(xiàn)的:一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理對(duì)樣本中中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2基因進(jìn)行核酸檢測(cè)。通過(guò)使用特異性引物，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)平臺(tái)擴(kuò)增靶基因0RFla2的特定區(qū)域，在陽(yáng)性和陰性質(zhì)控和內(nèi)對(duì)照檢測(cè)體系的輔助下，從分子水平對(duì)樣本中的中東呼吸綜合征冠狀病毒進(jìn)行篩查或檢測(cè)。
[0008]所述的LAMP技術(shù)平臺(tái)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域是指中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2基因的特定靶赫酸序列區(qū)域。
[0009]進(jìn)一步地，在本發(fā)明所述的篩查檢測(cè)方法中，在LAMP對(duì)樣本篩查過(guò)程中引入了陰陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)系統(tǒng)，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控品為相同于擴(kuò)增冠狀病毒靶基因0RFla2的RNA，陰性對(duì)照質(zhì)控品為不相同于擴(kuò)增冠狀病毒靶基因0RFla2的RNA，并使用時(shí)間分辨濁度法或Smartgreen熒光染料紫外燈下顯色法同時(shí)檢測(cè)陰陽(yáng)對(duì)照和中東呼吸綜合征冠狀病毒靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0010]在現(xiàn)有的LAMP技術(shù)的公開(kāi)文獻(xiàn)中，沒(méi)有將LAMP用于中東呼吸綜合征冠狀病毒篩查的報(bào)道。本發(fā)明通過(guò)使用特異性引物，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)平臺(tái)擴(kuò)增靶基因0RFla2的特定區(qū)域，在一系列和內(nèi)對(duì)照檢測(cè)體系的輔助下，從分子水平對(duì)樣本中的中東呼吸綜合征冠狀病毒進(jìn)行篩查或檢測(cè)。
[0011]本發(fā)明具有嚴(yán)格的鑒別篩查診斷體系，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該鑒別篩查診斷系統(tǒng)由陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品，內(nèi)對(duì)照質(zhì)控品以及相關(guān)擴(kuò)增和檢測(cè)體系組成。
[0012]本發(fā)明中鑒別篩查診斷系統(tǒng)的陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品是每批試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果是否有效的重要標(biāo)志。對(duì)于每批試驗(yàn)，必須引入一個(gè)陰性質(zhì)控品的檢測(cè)，以保證反應(yīng)體系不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；對(duì)于每批實(shí)驗(yàn)，必須引入一個(gè)中東呼吸綜合征冠狀病毒陽(yáng)性質(zhì)控品的檢測(cè)，以保證反應(yīng)體系不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。針對(duì)中東呼吸綜合征冠狀病毒的陽(yáng)性質(zhì)控品是人工構(gòu)建的包含中東呼吸綜合征冠狀病毒待檢靶序列的質(zhì)粒DNA。
[0013]本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物均通過(guò)核酸合成設(shè)備制備。核酸合成設(shè)備可選用不同廠家，不同型號(hào)的產(chǎn)品，也可委托相關(guān)的基因公司合成。所有引物按照LAMP引物設(shè)計(jì)原則，通過(guò)日本榮研化學(xué)網(wǎng)站(WWW.eiken.c0.jp)上引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的LAMP體系及反應(yīng)程序均由發(fā)明人設(shè)計(jì)，中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2基因的核酸特異性引物序列、LAMP反