專利名稱：一種修飾的豬繁殖與呼吸綜合征病毒orf5基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)及基因工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因的修飾，還涉及該基因修飾后的免疫原性評價(jià)及其在新型疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，簡稱PRRS，下文簡稱PRRS)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的病毒性傳染病，以母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱仔等繁殖障礙及各種年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病和高死亡率為特征。該病最早于1987年報(bào)道于美國南部，不久即傳播到了中西部，并在全美迅速蔓延。隨后加拿大、德國、荷蘭等一些國家也先后暴發(fā)了該病(Bilodeau R et al，Porcine reproductive andrespiratory syndrome in Quebec.Vet Rec，1991，129102-103；Dea S，Bilodeau R，Athanassious R et al.Swine reproductive and respiratory syndrome virus in Quebecisolation of an enveloped virus serologically-related to lelystad virus.Can Vet J.1992，33801-808)；亞洲地區(qū)報(bào)道此病的時(shí)間相對較晚，中國臺灣地區(qū)1991年出現(xiàn)此病(張志成等，臺灣地區(qū)豬繁殖與呼吸道征候群I病毒鑒定，中華獸醫(yī)雜志，1993，19(4)268-276)；日本1994年暴發(fā)PRRS(Hiroyoshi Kuwaahara.An outbreak of PRRS in Japan.J Vet Med Sci，1994，56(50)901-909)；中國大陸1996年報(bào)道此病開始流行，并分離到病毒(郭寶清等，從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離豬生殖與呼吸綜合征病毒的研究，中國畜禽傳染病，1996，87(2)1-5)。上述文獻(xiàn)顯示豬繁殖與呼吸綜合征給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，僅1991年歐洲PRRS的暴發(fā)就造成了100萬頭豬的死亡。
同其它許多豬的病毒病的防制一樣，PRRS的防制也主要是免疫預(yù)防。目前用于預(yù)防PRRS的主要是弱毒苗和滅活苗。盡管弱毒疫苗能提供較好的免疫保護(hù)，但存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，并且返強(qiáng)的機(jī)率相當(dāng)高，這一點(diǎn)也在幾年前丹麥等國因廣泛使用弱毒苗而導(dǎo)致該病大暴發(fā)中得以證實(shí)。與弱毒苗相比，滅活疫苗雖然安全，但往往需要反復(fù)多次的免疫接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗?？梢哉f，目前對該病的防制一直不盡人意，迫切需要更加安全、有效的疫苗來預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行。
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV，下文簡稱PRRSV)ORF5基因編碼的糖蛋白GP5是PRRSV中最主要的保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，而且目前確定的最主要的中和表位也位于其N端胞外區(qū)，因此是設(shè)計(jì)PRRS新型疫苗的首選目標(biāo)基因(Dea S，Gagnon CA，Mardassi H.Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratorysyndrome viruscomparison of the North American and European isolates.Arch Virol，2000a，145659-688)。1998年P(guān)irzaden等(Pirzadeh B，Dea S.Immune response in pigsvaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus.J Gen Virol，1998a，79989～999)用編碼GP5的真核表達(dá)質(zhì)粒免疫豬，可使接種豬產(chǎn)生抗GP5的特異性抗體，接種豬可免于強(qiáng)毒攻擊造成的全身性病毒血癥和肺部病變，并使間質(zhì)性肺炎和支氣管肺泡炎明顯減輕。1999年Kwang等(KwangJ，Zuckermann F，Ross G，et al.Antibody and cellular immune responses of swine followingimmunization with plasmid DNA encoding the PRRS virus ORFs4，5，6 and 7.vet Sci，1999，67199～201)用編碼GP4、GP5、M、N 4種結(jié)構(gòu)蛋白的基因構(gòu)建了4種DNA疫苗，免疫豬中，表達(dá)GP5的質(zhì)粒激發(fā)的抗體具有最強(qiáng)的中和病毒的能力。但上述研究均發(fā)現(xiàn)表達(dá)GP5蛋白的DNA疫苗誘導(dǎo)的中和抗體不高(＜1∶8)。最近，Ostrouski等(Ostrowski M，Galeota JA，Jar AM，et al.Identification of neutralizing and nonneutralizingepitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain.JVirol，2002，764241～4250)在采用噬菌體表面展示技術(shù)確定GP5中和表位時(shí)，發(fā)現(xiàn)與中和表位緊鄰的上游存在一個(gè)非中和表位，此表位具有類似于HIV中覆蓋表位的覆蓋效應(yīng)，也正是這一覆蓋表位的覆蓋效應(yīng)，導(dǎo)致GP5中和表位無法充分暴露，從而難以激發(fā)很強(qiáng)的中和抗體?；谶@一發(fā)現(xiàn)，申請人對ORF5基因進(jìn)行了修飾，即將人工合成的編碼輔助性T淋巴細(xì)胞表位的核苷酸插入GP5的中和表位和覆蓋表位間，并以DNA免疫的方式比較了修飾與未修飾的ORF5基因的免疫原性與免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ORF5基因進(jìn)行修飾，以暴露其中和表位，獲得一種免疫原性更好的ORF5基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒修飾的ORF5基因的DNA疫苗及其在防制豬繁殖與呼吸綜合征中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)施一種修飾的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO1所示。
一種修飾的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因是將人工合成的編碼輔助性T淋巴細(xì)胞表位的核苷酸序列插入GP5的中和表位和覆蓋表位間而獲得。
所述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒修飾的ORF5基因的DNA疫苗是將修飾的ORF5基因插入真核表達(dá)載體pCI-neo的XhoI與XbaI位點(diǎn)構(gòu)建而成，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌Escherichia coli DH5α/pCI-52M，保藏在CCTCC，保藏號為CCTCC NOM204080，保藏日期2004年10月29日。
本發(fā)明還包括上述修飾的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因在制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗上的應(yīng)用。
更詳細(xì)的技術(shù)方案如下列步驟所述一、PRRSV ORF5基因的修飾和表達(dá)修飾的ORF5基因的DNA疫苗的構(gòu)建
1、引物的設(shè)計(jì)采用PCR擴(kuò)增和拼接方法，將人工合成的編碼輔助性T淋巴細(xì)胞表位的核苷酸序列引入ORF5基因的中和表位與覆蓋表位之間。引物P51和P5m1，可擴(kuò)增ORF5基因N端96bp，并同時(shí)引入長39bp的PADRE表位，兩端依次設(shè)計(jì)XhoI和PstI酶切位點(diǎn)。P5m2和P52，可擴(kuò)增ORF5基因后一部分的507bp，兩端依次設(shè)計(jì)PstI和XbaI酶切位點(diǎn)。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下P515’-GAACTCGAGAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3’(序列表SEQ ID NO2)P5m15’-TTTCTGCAGAGCGGCAGCCTTCAGGGTCCAGGCAGCCACGAACTTGGCGTTGGC-GTTGACGAGC-3’(序列表SEQ ID NO3)P5m25’-TTTCTGCAGAGCAACAGCAGCCTCTC-3’(序列表SEQ ID NO4)P525’-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3’(序列表SEQ ID NO5)2、PCR擴(kuò)增以含PRRSV YA株(參見方六榮等，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒YA株ORF5基因的克隆與序列分析，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(6)501-505)完整ORF5基因的質(zhì)粒pMD-ORF5為模板進(jìn)行擴(kuò)增，ORF5基因兩部分序列的擴(kuò)增條件均為95.0℃5min變性后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95.0℃ 1min，55.0℃ 1min，72.0℃ 1min，35個(gè)循環(huán)后72.0℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后于1.0％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。
3、修飾的ORF5基因的獲得及其DNA疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建將上述兩種PCR產(chǎn)物ORF5ml與ORF5m2分別用XhoI+PstI和PstI+XbaI酶切后，將兩種純化回收的酶切產(chǎn)物同時(shí)與用XhoI+XbaI酶切的pCI-neo真核表達(dá)載體質(zhì)粒連接，獲得修飾改造后的表達(dá)ORF5基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-52M，經(jīng)XhoI、XhoI+XbaI、PstI酶切與PCR鑒定證實(shí)構(gòu)建正確。質(zhì)粒的重組、制備、酶切分析均按常規(guī)方法進(jìn)行(J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著。黃培堂，王嘉璽等譯。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002)。
二、用于對比試驗(yàn)的表達(dá)未修飾的ORF5基因的DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pCI-52的構(gòu)建設(shè)計(jì)一對可擴(kuò)增ORF5完整編碼區(qū)的引物P51S和P51R，上下游引物兩端分別設(shè)計(jì)了XhoI和XbaI位點(diǎn)。引物序列如下P51S5’-GAACTCGAGAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3’P51R5’-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3’以pMD-ORF5(參見方六榮等，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒YA株ORF5基因的克隆與序列分析，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(6)501-505)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增大小為619bp。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min；進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。純化回收目的片段，純化的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoI、XbaI酶切后，直接克隆到真核表達(dá)載體pCI-neo(Promega)的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得的重組質(zhì)粒pCI-52經(jīng)XhoI、XbaI和XhoI+XbaI酶切與PCR鑒定證實(shí)構(gòu)建正確，測序證實(shí)無堿基誤配。質(zhì)粒的重組、制備、酶切分析均按常規(guī)方法進(jìn)行(J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002年)。
三、質(zhì)粒pCI-52M、pCI-52的大量制備(1)挑取含有質(zhì)粒的菌落接種于75mL含終濃度為60μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃ 300r/min培養(yǎng)過夜，6000r/min 5min，收集細(xì)胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，高壓滅菌后置4℃保存?zhèn)溆?懸浮(吹散或渦旋)。
(2)加6mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用)，冰浴7-10min。
(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸鉀，冰醋酸調(diào)pH值至4.8)，冰浴7-10min。4℃ 10000r/min 10-15min。
(4)取上清，加0.6倍體積的異丙醇，混勻，-20℃ 30min或室溫5min。室溫，10000r/min 6-15min。
(5)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mL TE(10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA)懸浮(洗壁20min左右)。
(6)加1.5ml即1倍體積冰預(yù)冷的5mol/L NH4Ac，混勻。4℃ 10000r/min 10min。
(7)將上清轉(zhuǎn)移至7mL的離心管，加1倍體積(3mL)的異丙醇混勻，-20℃作用30min。12000r/min 15min。
(8)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500μL TE懸浮(洗壁20min左右)，并轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管。
(9)加入適量的RNase，37℃ 1h，去RNA。
(10)加1倍體積的13％的PEG8000(含1.6mol/L NaCl)，混勻，-20℃ 30min(可以過夜)。離心，棄上清，用400μLTE重溶。
(11)加等體積酚∶氯仿∶異戊醇抽提2次，氯仿∶異戊醇抽提1次。
(12)加100μl 10mol/L NH4Ac，充分混勻后，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃ 12000r/min離心5-10min。
(13)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50μL TE或H2O重溶，置-20℃?zhèn)溆谩?br> 四、DNA疫苗的生產(chǎn)工藝疫苗生產(chǎn)工藝的主要流程質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的大量提取、質(zhì)粒濃度的測定與稀釋。
1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pCI-52M和pCI-52(氨芐抗性)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。具體操作是1)取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌的1.5ml EP管中，加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min。2)將離心管放到預(yù)先加溫到42℃的循環(huán)水浴中熱沖擊90秒。3)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min。4)每管加400μl LB培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將離心管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇。為達(dá)到有效轉(zhuǎn)化，復(fù)蘇時(shí)轉(zhuǎn)速不宜超過225轉(zhuǎn)/分。5)取100μl轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含終濃度為60μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平皿上，用一無菌彎頭玻棒將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均勻地涂布到瓊脂平板表面。6)將平皿置37℃培養(yǎng)，直至液體被吸收，然后倒置平皿培養(yǎng)，12～16h可出現(xiàn)菌落。
2、質(zhì)粒的大量提取同本說明書的“二、質(zhì)粒pCI-52M的大量制備”的方法(本段省略了該質(zhì)粒的詳細(xì)制備步驟)。
3、質(zhì)粒濃度的測定、稀釋利用分光光度計(jì)測定大提質(zhì)粒的濃度，用磷酸鹽緩沖液(PBS pH7.4)將其稀釋到1μg/μl，即可用于動(dòng)物注射。
五、疫苗的免疫效力檢驗(yàn)1、疫苗對Balb/c小白鼠的免疫效力試驗(yàn)將DNA疫苗pCI-52M和pCI-52分別經(jīng)后腿肌肉注射6周齡的Balb/c小鼠，每組6只，每只小鼠100μl(含100μg質(zhì)粒)，共免疫2次，間隔2周；同時(shí)用空白質(zhì)粒載體pCI-neo作為核酸免疫的陰性對照。于首次免疫后2、4、6周經(jīng)尾靜脈負(fù)壓采血，分離血清，檢測ELISA抗體和中和抗體，結(jié)果表達(dá)修飾的ORF5基因的DNA疫苗pCI-52M誘導(dǎo)的ELISA抗體和中和抗體均明顯高于表達(dá)未修飾的ORF5基因的DNA疫苗pCI-52(詳見實(shí)施例2)。
2、疫苗對斷奶仔豬的免疫效力試驗(yàn)將DNA疫苗pCI-52M和pCI-52分別經(jīng)頸部肌肉注射斷奶仔豬，每組4頭，每頭豬500μl(含100μg質(zhì)粒)，共免疫3次，間隔2周；同時(shí)用空白質(zhì)粒載體pCI-neo作為核酸免疫的陰性對照。于首免后6周、8周、10周分別經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清，檢測ELISA抗體和中和抗體水平，同時(shí)采集抗凝血，分離淋巴細(xì)胞檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果表達(dá)修飾的ORF5基因的DNA疫苗pCI-52M誘導(dǎo)的體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)均明顯高于表達(dá)未修飾的ORF5基因的DNA疫苗pCI-52(詳見實(shí)施例3)。
序列表及


序列表SEQ ID NO.1是本發(fā)明修飾后的ORF5基因的序列序列表SEQ ID NO2-5為本發(fā)明中用于PCR擴(kuò)增的引物圖1顯示了修飾后的ORF5基因的序列，圖中黑體字表示的堿基是插入的人工合成的編碼輔助性T淋巴細(xì)胞表位的核苷酸序列。
圖2顯示了PRRSV YA株修飾的ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和未修飾的ORF5基因DNA疫苗pCI-52的結(jié)構(gòu)3顯示了未修飾的ORF5基因DNA疫苗pCI-52的酶切與PCR鑒定結(jié)果圖4顯示了修飾的ORF5基因DNA疫苗pCI-52M的酶切與PCR鑒定結(jié)果圖5顯示了PRRSV YA株ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和pCI-52免疫Balb/c小鼠后的ELISA抗體水平圖6顯示了PRRSV YA株ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和pCI-52免疫Balb/c小鼠后誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平(脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù))圖7顯示了PRRSV YA株ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和pCI-52免疫斷奶仔豬后的ELISA抗體水平圖8顯示了PRRSV YA株ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和pCI-52免疫斷奶仔豬后誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平(外周血單核細(xì)胞刺激指數(shù))具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不是限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1含有本發(fā)明修飾的基因的質(zhì)粒和含有對照基因的質(zhì)粒的制備1、表達(dá)未修飾的ORF5基因(對照)的真核質(zhì)粒pCI-52的構(gòu)建以pMD-ORF5為模板，P52S和P52R為引物擴(kuò)增ORF5基因，純化的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoI、XbaI酶切后，直接克隆到真核表達(dá)載體pCI-neo的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pCI-52。其結(jié)構(gòu)見圖2，酶切與PCR鑒定結(jié)果見附圖3(XhoI、XbaI酶切均只有一條約6000bp的帶、XhoI+XbaI酶切產(chǎn)生一條約600bp和一條約5400bp的帶、PCR擴(kuò)增出一條約600bp的帶)。
2、表達(dá)修飾的ORF5基因的真核質(zhì)粒pCI-52M的構(gòu)建以pMD-ORF5為模板，利用引物p51和p5m1擴(kuò)增ORF5基因的N端96bp，其中引入了長39bp的PADRE表位；再利用引物p5m2和p52擴(kuò)增ORF5基因的后一部分約507bp。兩端PCR產(chǎn)物純化后分別以XhoI+PstI和PstI+XbaI酶切，回收純化后，同時(shí)與用XhoI+XbaI酶切的真核表達(dá)載體pCI-neo連接，獲得表達(dá)修飾后的ORF5基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-52M，結(jié)構(gòu)見圖2，酶切與PCR鑒定結(jié)果見附圖4(XhoI酶切產(chǎn)生一條約6.1bp的帶、XhoI+XbaI產(chǎn)生一條約5.5bp和一條約0.6bp的帶、PstI酶切產(chǎn)生3條帶0.4bp、2.0bp、3.7bp、PCR擴(kuò)增出一條約0.6bp的帶)。
實(shí)施例2本發(fā)明的DNA疫苗和對照疫苗對小鼠免疫效力的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1、Balb/c小鼠的免疫程序?qū)alb/c小鼠分為3組，每組6只，采用后腿肌肉注射，每只小鼠100μl(含100μg質(zhì)粒)，共免疫2次，間隔2周，同時(shí)用空白質(zhì)粒載體pCI-neo作為核酸免疫的陰性對照。在首免后2、4、6周經(jīng)尾靜脈負(fù)壓采血，分離血清，檢測ELISA抗體和中和抗體。
2、ELISA抗體水平采用大腸桿菌表達(dá)和純化的GP5蛋白作抗原，檢測血清中的ELISA抗體水平，結(jié)果顯示經(jīng)修飾改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫組誘導(dǎo)的ELISA抗體要明顯高于未經(jīng)修飾的DNA疫苗pCI-52免疫組(P＜0.05，t-test)，表明修飾后的GP5具有更好的免疫原性，結(jié)果如附圖5。
3、中和抗體水平采用Yoon等(Yoon IJ，Joo HS，Goyal SM.A modified serum neutralization test forthe detection of antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swinesera.J Vet Diagn Invest，1994，6289-292)報(bào)道的改良的中和抗體檢測方法，檢測血清中的中和抗體水平，結(jié)果與ELISA抗體結(jié)果一致，未經(jīng)修飾的DNA疫苗pCI-52免疫組的中和抗體水平不高，并且上升得較為緩慢，而修飾改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫組的中和抗體快速上升，于第6周達(dá)到了1∶16，與pCI-52免疫組相比差異極顯著(P＜0.01，t-test)，試驗(yàn)結(jié)果如表1。
表1 Balb/c小鼠首免后第4周、6周的中和抗體水平

注ND表示未做4、細(xì)胞免疫水平檢測采用MTT法測定小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)(SI)(沈關(guān)心，周汝麟主編，《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998)。結(jié)果經(jīng)修飾改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫組的刺激指數(shù)要明顯高于未經(jīng)修飾的DNA疫苗pCI-52免疫組(P＜0.05，t-test)。試驗(yàn)結(jié)果如附圖6所示。
實(shí)施例3本發(fā)明的DNA疫苗和對照疫苗對斷奶仔豬免疫效力的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1、豬的免疫程序斷奶仔豬隨機(jī)分成5組，每組4頭，采用頸部肌肉注射，每頭豬500μL(含100μg質(zhì)粒)，共免疫3次，間隔2周，同時(shí)用空白質(zhì)粒載體pCI-neo作為核酸免疫的陰性對照。于首免后6周、8周、10周分別經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清，檢測ELISA抗體和中和抗體水平，同時(shí)采集抗凝血，分離淋巴細(xì)胞檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。
2、ELISA抗體檢測采用大腸桿菌表達(dá)和純化的GP5蛋白作抗原，檢測血清中的ELISA抗體水平，結(jié)果經(jīng)修飾改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫組誘導(dǎo)的ELISA抗體要明顯高于未經(jīng)修飾的DNA疫苗pCI-52免疫組(P＜0.05，t-test)，表明修飾后的GP5具有更好的免疫原性，結(jié)果如圖7。
3、中和抗體檢測采用Yoon等(Yoon IJ，Joo HS，Goyal SM.A modified serum neutralization test for thedetection of antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine sera.JVet Diagn Invest，1994，6289-292)報(bào)道的改良的中和抗體檢測方法，檢測血清中的中和抗體水平，結(jié)果與ELISA抗體結(jié)果一致，未經(jīng)修飾的DNA疫苗pCI-52免疫組的中和抗體水平不高，到首免后第10周所有免疫豬的中和抗體均在1∶4以下，而修飾改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫組的中和抗體上升較快，于首免后第6周就有2頭豬的中和抗體達(dá)到了1∶4，到首免后第10周有3頭豬的中和抗體都達(dá)到了1∶8，與pCI-52免疫組相比差異極顯著(P＜0.01，t-test)，試驗(yàn)結(jié)果如表2。
表2 豬首免后第6周、8周、10周的中和抗體水平

4、細(xì)胞免疫水平檢測采用MTT法測定免疫豬外周血單核細(xì)胞的刺激指數(shù)(SI)(沈關(guān)心，周汝麟主編?！冬F(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998)，結(jié)果經(jīng)修飾改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫組的刺激指數(shù)要明顯高于未經(jīng)修飾的DNA疫苗pCI-52免疫組(P＜0.05，t-test)。試驗(yàn)結(jié)果如附圖8所示。
序列表<120>一種修飾的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因及應(yīng)用<130>
<141>2004-11-03<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>648<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(648)<223>
<220>
<221>modified_base<222>(97)..(141)<223>
<400>1atgttgggga aatgcttgac cacgggctgt tgctcgcgat tgctttcttt gtggtgtatc 60gtgccgttct gttttgctgt gctcgtcaac gccaacgcca agttcgtggc tgcctggacc120ctgaaggctg ccgctctgca gagcaacagc agctctcatt ttcagttgat ttataacttg180acgctatgtg agctgaatgg cacagattgg ctggctaaca aatttgactg ggcagtggag240acttttgtca tctttcccgt gttgactcac attgtttcct atggggcact caccaccagc300catttccttg acacagttgg tctggtcact gtgtccaccg ccgggtttta tcacgggcgg360tatgtcttga gtagcatcta cgcggtctgt gctctggctg cgttgatttg cttcgtcatt420aggcttgcga agaactgcat gtcctggcgc tactcttgta ccagatatac caacttcctt480ctggacacta agggcagact ctatcgttgg cggtcgcccg ttattgtaga gaaagggggt540aaggttgagg tcgagggtca cctgatcgac ctcaaaagag ttgtgcttga tggttccgtg600gcaacccctt taaccagagt ttcagcggaa caatggggtc gtctctag 648<210>2<211>33<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(33)<223>
<400>2gaactcgaga gtatgttggg gaaatgcttg acc 33<210>3<211>64<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
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<223>
<400>3tttctgcaga gcggcagcct tcagggtcca ggcagccacg aacttggcgt tggcgttgac 60gagc 64<210>4<211>26<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(26)<223>
<400>4tttctgcaga gcaacagcag cctctc 26<210>5<211>28<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>protein_bind<222>(1)..(28)<223>
<400>5ttttctagag acgaccccat tgttccgc 28
權(quán)利要求
1.一種修飾的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因，其特征在于，將人工合成的編碼輔助性T淋巴細(xì)胞表位的核苷酸序列插入GP5的中和表位和覆蓋表位間而獲得，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，該修飾基因包含在真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-52M中，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌Escherichia coli DH5α/pCI-52M，保藏在CCTCC，保藏號為CCTCC NOM204080，保藏日期2004年10月29日。
2.權(quán)利要求1所述的修飾的ORF5基因在制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種修飾的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因及其應(yīng)用。其特征在于，將人工合成的編碼輔助性T淋巴細(xì)胞表位的核苷酸序列插入GP5的中和表位和覆蓋表位間，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1和附圖1所示。該修飾基因包含在真核表達(dá)質(zhì)粒pCI－52M中，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌Escherichia coliDH5α/pCI－52M，保藏在CCTCC，保藏號為CCTCC NOM204080。本發(fā)明還公開了該基因在制備豬繁殖與呼吸綜合征DNA疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/12GK1778926SQ200410009838
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者方六榮, 陳煥春, 江云波, 肖少波, 金梅林, 吳斌, 劉正飛 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)