一種分子量11400d和19490d高純度漆籽多糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子量11400D和19490D高純度漆籽多糖的制備方法，屬于天然藥物、食品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]漆樹(RhusvernicifIua stokes)，為漆樹科(Anacardiaceae)漆樹屬((Toxicodendron)的一種落葉喬木。漆樹是我國重要的特用經(jīng)濟(jì)林，生漆是天然樹脂涂料，素有“涂料之王”的美譽(yù)。主要分布在北瑋25?42°，東經(jīng)95?125°之間的山區(qū)，其中秦巴山地和云貴高原為漆樹分布集中地區(qū)。生漆是漆樹分泌物，為天然樹脂涂料，素有“涂料之王”的美譽(yù)。
[0003]漆籽為漆樹的果實(shí)，其中果皮為蠟質(zhì)層，可以提取漆蠟，內(nèi)核為種子，可榨取漆油，在我國現(xiàn)有的漆樹資源中，每年的漆籽產(chǎn)量約為200多萬噸。目前對漆籽的研究主要集中在漆脂的提取及精制加工等方面，董艷鶴等[2 3]研究了熱回流提取漆蠟的單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化漆蠟提取的最佳工藝，并采用GC-MS色譜分析了陜西野漆樹和江西引種日本野漆樹中漆蠟脂肪酸的化學(xué)成分，兩個產(chǎn)地的漆蠟主要脂肪酸組成為棕桐酸、油酸和硬脂酸等。并進(jìn)一步研究了漆蠟的脫色精制工藝，采用該方法制得的漆蠟的白度達(dá)85.2。漆樹籽柏是漆籽壓榨完后主要的剩余物，目前對它的開發(fā)利用尚屬空白。為了擴(kuò)大漆樹產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；由炱針滟Y源的產(chǎn)業(yè)鏈，因此開展漆樹籽柏中多糖的提取和分離研究，對于漆樹資源的開發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種分子量11400D和19490D高純度漆籽多糖的制備方法，通過對漆樹籽柏多糖的分離純化，得到純度為95%以上的漆樹籽柏多糖成分。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種分子量11400D和19490D高純度漆籽多糖的制備方法，所述的分子量11400D和19490D多糖含量為95%，所述的分子量11400D多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖組成，所述的分子量19490D多糖由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖組成。
[0006]所述的一種分子量11400D和19490D高純度漆籽多糖的制備方法，其特征在于由以下步驟組成:
第一步
將漆樹籽柏干燥、粉碎，按質(zhì)量比1:5~1:30 (g:mL)，加入石油醚或正己烷，常溫或加熱回流提取2~3次，每次2h~10h，過濾，濾液合并，于40~60°C下減壓蒸發(fā)回收溶劑，濾渣經(jīng)過減壓干燥，得到脫脂籽柏；
第二步
將脫脂籽柏，按質(zhì)量比1:5~1:30 (g:mL)，加入蒸餾水，加熱回流提取2~3次，溫度60?90 °C，提取時間lh~5h，過濾，濾液合并，于50?70 0C下減壓濃縮，濃縮液按體積比I?10:30 (v/v)的比例加入無水乙醇，進(jìn)行醇沉，離心得到沉淀，沉淀進(jìn)行干燥，即為漆樹籽柏粗多糖；
第三步
將漆樹籽柏粗多糖，按質(zhì)量比1:3~1:5 (g:mL)，加入蒸餾水，配制成3mg/mL的漆樹籽柏粗多糖水溶液，按體積比1:5~1:10 (v/v)，加入Sevag試劑萃取3?5次，分離，取水層，合并，經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得到漆樹籽柏多糖提取物；
第四步
將上述得到的漆樹籽柏多糖提取物，用蒸餾水配制成濃度為50mg/mL的多糖水溶液，采用DEAE-纖維素-52層析柱進(jìn)行分離，依次采用2倍柱體積(BV)的蒸餾水、IBV的0.1mol/L NaClUBV 的 0.3mol/L NaClUBV 的 0.5mol/L NaCl 和 IBV 的 0.7mol/L NaCl 溶液進(jìn)行階梯式洗脫，以1mL為一管進(jìn)行分管收集；收集液進(jìn)行多糖含量檢測，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集各部位多糖洗脫液；將合并的各部位的洗脫液，采用分子量為3000道爾頓的透析袋進(jìn)行透析除鹽24h?48h，濃縮透析液，經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得到漆樹籽柏多糖組分 JP2 和 JP3 ;
第五步
將上述得到的漆樹籽柏多糖組分JP2和JP3，用蒸餾水分別配制成濃度為5?1mg/mL的多糖水溶液，再分別采用葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行分離，采用2倍柱體積(BV)的蒸餾水進(jìn)行洗脫，以1mL為一管進(jìn)行分管收集；收集液進(jìn)行多糖含量檢測，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集各部位多糖洗脫液，經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得到漆樹籽柏多糖組分JP2-1和JP3-1 ；
第六步
將漆樹籽柏多糖組分JP2-1和JP3-1進(jìn)行HPLC分析，多糖組分JP2-1為分子量11400D的漆籽多糖，多糖組分JP3-1為分子量19490D的漆籽多糖。
[0007]3.分子量11400D多糖組分中鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的摩爾比為41.93:21.8:1.01:9.24，分子量19490D多糖組分中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩爾比為38.31:16.44:1.1。
[0008]4.第一步中的漆樹籽柏是來源于野漆樹、漆樹和緬紅漆品種的一種漆籽經(jīng)過壓榨后的籽柏。
[0009]5.第一步中的加熱回流提取的溫度為40?80°C。
[0010]6.第五步中的葡聚糖凝膠選自650、6100、6150、6200和6250中的一種或幾種。
[0011]7.第六步中HPLC分析，其色譜條件為:色譜柱為Ultrahydrogel Linear(7.8X300mm, 10 μm),保護(hù)柱為 Ultrahydrogel (6X40mm, 6 μm)，流動相為 0.lmol/L 的硝酸鈉水溶液，示差檢測器，流速為lmL/min，溫度為50°C，進(jìn)樣量20 μ L0
[0012]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明所提供一種分子量11400D和19490D高純度漆籽多糖的制備方法，還具有以下特點(diǎn):
(I)本發(fā)明操作工藝簡單，通過脫脂、提取、醇沉、離子色譜和凝膠色譜分離，得到純度為95%的分子量為11400D和19490D的高純度漆籽多糖； (2)本發(fā)明對分子量11400D和19490D的漆樹籽柏多糖的單糖組成及比例進(jìn)行了初步分析，為以后漆樹籽柏多糖的分子結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步深入研究提供理論基礎(chǔ)。
[0013]
【附圖說明】
[0014]圖1為漆樹籽柏多糖提取物的DEAE-52洗脫曲線圖；
圖2為漆樹籽柏多糖組份JP2-1的HPLC圖；
圖3為漆樹籽柏多糖組份JP3-1的HPLC圖。
[0015]
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。
[0017]實(shí)施例1苯酚硫酸法測定多糖含量
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:稱取葡萄糖0.0lg，用蒸餾水定溶于50 mL容量瓶中，取8個10mL試管標(biāo)號(空白，1，2，…7)，吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.7,0.9 mL，分別置于1-7號試管，補(bǔ)加蒸饋水至終體積為1.0 mL，再加入5% (w/w)苯酸1.0 mL，震蕩搖勻，緩慢加入濃硫酸3.5 mL,迅速震蕩搖勻，室溫下顯色25分鐘后吸取250 μ L到96孔板，每樣三個孔，490 nm處測定吸光度，取平均值，蒸餾水為空白對照。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.0081x-0.0139(R2=0.9992 )，表明兩變量線性相關(guān)性較好。
[0018]粗多糖含量測定:精確稱取0.05 g粗多糖于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定溶，分別吸取0.3，0.5，0.7，0.9 mL溶液與1mL試管中，補(bǔ)加蒸餾水至終體積為1.0mL,再加入5%(w/w)苯酚1.0 mL，震蕩搖勻，緩慢加入濃硫酸3.5 mL,迅速震蕩搖勻，室溫下顯色25分鐘后吸取250 μ L到96孔板，每樣三個孔，490 nm處測定吸光度，取平均值。
[0019]實(shí)施例2
取500g的漆樹籽柏，按照質(zhì)量比1:5 (g:mL)加入石油醚，常溫提取3次，每次10h，過濾，濾液合并，于40°C下回收溶劑，濾渣經(jīng)過減壓干燥，得到脫脂籽柏；將脫脂籽柏，按質(zhì)量比1:5 (g:mL)，加入蒸饋水，于60°C下，加熱回流提取5h，提取3次，過濾，濾液合并，于50°C下減壓濃縮，濃縮液按體積比1:10加入無水乙醇，進(jìn)行醇沉，離心得到沉淀，沉淀進(jìn)行干燥，得到漆樹籽柏粗多糖。將漆樹籽柏粗多糖，按質(zhì)量比1:3 (g:mL)，加入蒸餾水，配制成3mg/mL的漆樹籽柏粗多糖水溶液，按體積比1:5 (V/V)，加入Sevag試劑萃取5次，分離，取水層，合并，經(jīng)真空干燥，得到漆樹籽柏多糖提取物。
[0020]實(shí)施例3
取500g的野漆樹籽柏，按照質(zhì)量比1:10 (g:mL)加入正己烷，常溫提取2次，每次8h，過濾，濾液合并，于60°C下回收溶劑，濾渣經(jīng)過減壓干燥，得到脫脂籽柏；將脫脂籽柏，按質(zhì)量比1:10 (g:mL)，加入蒸餾水，于80°C下，加熱回流提取2h，提取2次，過濾，濾液合并，于70°C下減壓濃縮，濃縮液按體積比1:20加入無水乙醇，進(jìn)行醇沉，離心得到沉淀，沉淀進(jìn)行干燥，得到漆樹籽柏粗多糖。將漆樹籽柏粗多糖，按質(zhì)量比l:5(g:mL)，加入蒸餾水，配制成3mg/mL的漆樹籽柏粗多糖水溶液，按體積比1:8 (V/V)，加入Sevag試劑萃取4次，分離，取水層，合并，經(jīng)冷凍干燥，得到漆樹籽柏多糖提取物。
[0021]實(shí)施例4
取500g的緬紅漆籽柏，按照質(zhì)量比1:30 (g:mL)加入正己烷，于40°C下加熱回流提取2次，每次4h，過濾，濾液合并，于60°C下回收溶劑，濾渣經(jīng)過減壓干燥，得到脫脂籽柏；將脫脂籽柏，按質(zhì)量比l:20(g:mL)，加入蒸餾水，于90°C下，加熱回流提取2h，提取2次，過濾，濾液合并，于50°C下減壓濃縮，濃縮液按體積比1:30加入無水乙醇，進(jìn)行醇沉，離心得到沉淀，沉淀進(jìn)行干燥，得到漆樹籽柏粗多糖。將漆樹籽柏粗多糖，按質(zhì)量比l:5(g:mL)，加入蒸餾水，配制成3mg/mL的漆樹籽柏粗多糖水溶液，按體積比1:10 (V/V)，加入Sevag試劑萃取5次，分離，取水層，合并，經(jīng)真空干燥，得到漆樹籽柏多糖提取物。
[0022]實(shí)施例5
取500g的漆樹籽柏，按照質(zhì)量比l:20(g:mL)加入石油醚，于80°C下加熱回流提取2次，每次2h，過濾，濾液合并，于60°C下回收溶劑，濾渣經(jīng)過減壓干燥，得到脫脂籽柏；將脫脂籽柏，按質(zhì)量比l:30(g:mL)，加入蒸餾水，于60°C下，加熱回流提取4h，提取3次，過濾，濾液合并，于60°C下減壓濃縮，濃縮液按體積比1:20加入無水乙醇，進(jìn)行醇沉，離心得到沉淀，沉淀進(jìn)行干燥，得到漆樹籽柏粗多糖。將漆樹籽柏粗多糖，按質(zhì)量比l:4(g:mL)，加入蒸餾水，配制成3mg/mL的漆樹籽柏粗多糖水溶液，按體積比1:8 (V/V)，加入Sevag試劑萃取3次，分離，取水層，合并，經(jīng)冷凍干燥，得到漆樹籽柏多糖提取物。
[0023]實(shí)施例6
將漆樹籽柏多糖提取物，用蒸餾水配制成濃度為50mg/mL的多糖水溶液，采用DEAE-纖維素-52層析柱進(jìn)行分離，依次采用2倍柱體積(BV)的蒸餾水、IBV的0.lmol/L NaClUBV的 0.3mol/L NaClUBV 的 0.5mol/L NaCl 和 IBV 的 0.7mol/L NaCl 溶液進(jìn)行階梯式洗脫，以1mL為一管進(jìn)行分管收集；收集液進(jìn)行多糖含量檢測，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集各部位多糖