荸薺多糖及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種純化荸薺多糖的制備法與表征。
【背景技術(shù)】
[0002] 荸薺 （Chinese Water Chestnut)又稱馬蹄、慈菇、燕尾草等，為莎草科荸薺屬植物 的球莖，由于其具有獨(dú)特的風(fēng)味，備受人們喜愛(ài)。荸薺除食用外，還具有一定的藥用價(jià)值，具 有降壓、涼血解毒、利尿通便、祛痰、消食除脹，抗菌等作用。有文獻(xiàn)記載荸薺具有一定的解 酒功效，開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景較好，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，荸薺中多糖具有良好的活性功能。
[0003] 荸薺具有良好的醫(yī)療保健效果，根據(jù)《中藥大辭典》記載，荸薺性味甘、微寒、無(wú)毒， 有溫中益氣、清熱開(kāi)胃、消食化痰之功效，在我國(guó)古典文獻(xiàn)和明間尚有荸薺解酒作用。通過(guò) 對(duì)荸#所含營(yíng)養(yǎng)成分分析顯不，每100克荸#鮮品中，含碳水化合物21. 8g、蛋白質(zhì)I. 5g、月旨 肪0. lg、粗纖維0. 5g、f丐5mg和磷68mg等，從所含有的營(yíng)養(yǎng)成分看，荸#中以碳水化合物和 蛋白類為主，脂肪含量較少。功能活性成分主要包括黃酮類、多酚類以及多糖類，關(guān)于荸薺 活性成分以及藥理作用研究的文獻(xiàn)報(bào)道較多，然而關(guān)于荸薺發(fā)揮功能作用的有效成分、作 用機(jī)制以及相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究更少，尤其對(duì)多糖類活性成分的結(jié)構(gòu)以及單糖組成的了解甚 少。
[0004] 荸薺中含量大量的黃酮類化合物，蔡建等研究表明荸薺中總黃酮的含量為 0.86%，同時(shí)有研究也發(fā)現(xiàn)荸薺中大部分黃酮類化合物主要集中在荸薺皮中，荸薺皮中總 黃酮含量平均值為1.59%，可見(jiàn)，荸薺中黃酮類化合物主要在皮部。此類黃酮類具有降血 月旨、降血壓、降血糖、抗癌、增強(qiáng)免疫力以及消炎抗菌等功效。植物多酚具有良好的抗氧化和 清除自由基作用，荸薺的蒂頭、芽點(diǎn)以及果皮、果肉之間的部位均富集以花青素為主的多酚 類物質(zhì)。在荸薺抗菌成分研究領(lǐng)域，英國(guó)學(xué)者曾經(jīng)在對(duì)荸薺的研究中發(fā)現(xiàn)了一種重要抗菌 成分一一荸薺英，該物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及綠膿桿菌具有顯著的抑制作用， 對(duì)降低血壓也有一定功能。國(guó)內(nèi)學(xué)者也研究發(fā)現(xiàn)，荸薺皮中含有一種抗菌物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的最 低抑菌濃度（MIC)為0. 3%，對(duì)大多數(shù)真菌的最低抑菌濃度為1. 25%，且穩(wěn)定性良好。而且 荸薺提取物不僅體外抗菌活性較強(qiáng)，對(duì)體內(nèi)抗菌能力也具有顯著作用和明顯了消炎功能。 此類研究提示我們，荸薺除了食用外，在食品保鮮、外用抗菌消炎類藥品研制等方面均具有 廣闊開(kāi)發(fā)前景。近年來(lái)，新加坡《中醫(yī)學(xué)報(bào)》曾報(bào)道，當(dāng)?shù)赜幂┧j來(lái)輔助治療食道癌。食品 加工過(guò)程中，亞硝胺是一類易于重要的致癌物，現(xiàn)代研究表明荸薺皮提取物可以明顯阻斷 亞硝胺合成以及清除煙硝酸鹽。
[0005] 除了上述天然活性成分之外，有研究發(fā)現(xiàn)荸薺中含有大量的多糖成分，關(guān)于其多 糖結(jié)構(gòu)組成、平均分子量以及生物功效等研究較少。
[0006] 目前，現(xiàn)僅有少量的研究報(bào)道了荸薺多糖的制備方法，有研究采用單因素基礎(chǔ)上 的正交實(shí)驗(yàn)，考察了不同料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)荸薺多糖的影響，結(jié)果顯示最佳提 取工藝為固液比為1:30,提取時(shí)間為3h，提取溫度為80°C ;該研究只對(duì)荸薺總多糖含量進(jìn) 行了簡(jiǎn)單測(cè)定，并未對(duì)所提取的多糖單糖結(jié)構(gòu)組成以及平均分子量分布等特征進(jìn)行測(cè)定。
[0007] 也有研究人員采用超聲波輔助法從荸薺中提取多糖，并研究了多糖性質(zhì)和組成， 其最佳提取工藝是料液比為1:12、超聲波輻射時(shí)間為40min、超聲功率為80W、溫度為70°C， 所提取荸薺多糖純度為78. 8%，理化性質(zhì)檢測(cè)顯示主要有葡萄糖和半乳糖組成，兩者摩爾 比為1:10,顯然該多糖單糖組成較單一，與本發(fā)明多糖在單糖組成上有較大差別，而且作者 并未對(duì)其分子量分布進(jìn)行表征。
[0008] 荸薺為我國(guó)長(zhǎng)江流域以南地區(qū)各省廣泛栽培的水生瓜果，荸薺不僅汁多味甜，營(yíng) 養(yǎng)豐富，而且具有多種保健作用及藥用價(jià)值，自古以來(lái)就有"地下雪梨"和"江南人參"的美 譽(yù)。長(zhǎng)期使用對(duì)人體沒(méi)有任何副作用。此外，荸薺類化合物來(lái)源豐富、價(jià)格低廉，開(kāi)發(fā)成本 較低。因此，利用荸薺提取物來(lái)研究和開(kāi)發(fā)相關(guān)功能產(chǎn)品具有良好的前景。
[0009] 雖然荸薺具有多種生物活性優(yōu)勢(shì)，但是其功能活性成分研究尚存在如下不足之 處：
[0010] 1、荸薺作為整體食用，由于其所含天然化學(xué)成分較多，主要活性成分不明確，尤其 對(duì)其中所含的多糖結(jié)構(gòu)了解甚少。
[0011] 2、由于荸薺中具有多糖、黃酮、多酚、維生素、氨基酸、微量元素等多種天然成分， 只有多糖為天然高聚物，然而關(guān)于荸薺多糖的平均分子量大小尚不知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種純化荸薺多糖及其制備方法。
[0013] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種荸薺多糖，其由以下摩爾含量的成分組 成：
[0014] 甘露糖 0.71%
[0015] 鼠李糖5%~16%
[0016] 半乳糖醛酸0.71%
[0017] 葡萄糖 76. 74% ~83. 82 %
[0018] 半乳糖 3. 48 % ~8. 51 %
[0019] 阿拉伯糖 1. 25%~2. 36% ;
[0020] 該荸薺多糖的Mn (數(shù)均分子量）為1. 116 X IO7~1. 137 XlO 7, Mw (重均分子量） 為L(zhǎng) 461 X IO7~L 618X10 7,多分散指數(shù)為L(zhǎng) 286~L 434。
[0021] 作為本發(fā)明的荸薺多糖的改進(jìn)，其由以下摩爾含量的成分組成：甘露糖0.71%、 鼠李糖10%、半乳糖醛酸0. 71%、葡萄糖82. 56%、半乳糖3. 98%以及阿拉伯糖2. 04%組 成；
[0022] 該荸薺多糖的Mn (數(shù)均分子量）為L(zhǎng) 137 X 107,Mw (重均分子量）為L(zhǎng) 461 X 107， 多分散指數(shù)為1. 286。
[0023] 本發(fā)明還同時(shí)提供了上述荸薺多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0024] 1)、先將去皮荸薺于榨汁機(jī)內(nèi)進(jìn)行粉碎榨汁，然后加入為去皮荸薺2. 5~3. 5倍重 量（較佳為3倍重量）的超純水于75~85°C (較佳為80°C )加熱2h ;接著過(guò)濾，分別得 濾液I和濾渣；
[0025] 在濾渣中加入為去皮荸#1.3~L 8倍重量（較佳為L(zhǎng) 5倍重量）的超純水，75~ 85°C (較佳為80°C )加熱lh，過(guò)濾，所得的濾液II與濾液I合并后得荸薺汁；
[0026] 將荸薺汁于3~5°C (較佳為4°C )靜置10~12小時(shí)（過(guò)夜），過(guò)濾出靜置所形 成的沉淀物（淀粉），所得的液體濃縮至為原體積的1/30~1/20,得濃縮后荸薺汁；
[0027] 2)、將氯仿：正丁醇=5:1體積比混合，得試劑（sevage試劑）；
[0028] 將濃縮后荸薺汁與該試劑按5:1的體積比混合，均勻攪拌（攪拌15min)后于 2000r/min離心10~60min，取上層液體；
[0029] 將上層液體與95 % (體積濃度）乙醇按照1:3~1:10的體積比例混合攪拌，3~ 5°C (較佳為4°C)的低溫下靜置10~12小時(shí)（過(guò)夜）、過(guò)濾，將過(guò)濾所得的濾餅用石油醚 洗滌（洗滌過(guò)程中實(shí)現(xiàn)除脂）后，得荸薺粗多糖；
[0030] 備注說(shuō)明：因?yàn)槭兔咽欠菢O性試劑，因此可用來(lái)除去濾餅中脂質(zhì)成分；
[0031] 3)、準(zhǔn)確稱取0. 5g荸養(yǎng)粗多糖，溶于IOml超純水中，高速離心（于6000r/min離心 IOmin)后取上清液，加入DEAE-52纖維素層析柱（內(nèi)裝90g的DEAE-52纖維素作為填料） 中，用流速為〇. 5~2. Oml/min的超純水洗脫，根據(jù)吸光度收集洗脫液（即，收集合并吸光 度比較集中洗脫液），然后蒸干（于l〇〇°C進(jìn)行蒸干）；
[0032] 備注說(shuō)明：洗脫時(shí)超純水的用量一般為3-9個(gè)柱體積，SMg填料配用3_5ml的超 純水；
[0033] 4)、將步驟3)的蒸干所得物溶于5ml超純水中，加入葡聚糖凝膠G-100層析柱（內(nèi) 裝20g的葡聚糖凝膠G-100)中，用流速為0. 5~2. Oml/min的超純水洗脫，根據(jù)吸光度收 集洗脫液（即，收集合并吸光度比較集中洗脫液），然后蒸干（于l〇〇°C進(jìn)行蒸干）；得荸薺 多糖（為純化的荸薺多糖）。
[0034] 備注說(shuō)明：洗脫時(shí)超純水的用量一般為3-9個(gè)柱體積。
[0035] 作為本發(fā)明的荸薺多糖的制備方法的改進(jìn)：
[0036] 所述步驟2)中：2000r/min離心30min，將上層液體與95% (體積濃度）乙醇按 照1:5的體積比例混合攪拌；
[0037] 所述步驟3)和步驟4)的洗脫，流速均為1.0 ml/min。
[0038] 本發(fā)明還對(duì)所得的荸薺多糖的解酒功能進(jìn)行了驗(yàn)證。
[0039] 本發(fā)明在發(fā)明過(guò)程中，使用了如下的評(píng)價(jià)方法：
[0040] (一）多糖化學(xué)組成和分子量的評(píng)價(jià)：
[0041 ] 方法一、單糖組成的評(píng)價(jià)
[0042] 準(zhǔn)確稱取一定量純化多糖于TFA中充氮?dú)馑?，然后利用PMP衍生化，氯仿 除脂后取水相過(guò)0. 22 μπι濾膜后，進(jìn)HPLC定量分析單糖組成；同時(shí)混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品作 為定性和定量標(biāo)準(zhǔn)。色譜條件為儀器：waters e2695;色譜柱：Agilent XDB-C 18柱 (4. 6mm X 250mm