一種扣囊復(fù)膜酵母及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種扣囊復(fù)膜酵母，同時涉及該扣囊復(fù) 膜酵母在產(chǎn)異戊醇中的用途。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 白酒釀造過程是多種微生物共同參與的過程。醬香型白酒是中國主要香型白酒， 其獨特的釀造工藝形成了大曲和酒醅中特殊的微生物區(qū)系。研究發(fā)現(xiàn)，在白酒釀造過程中， 產(chǎn)生的醇類除乙醇外，產(chǎn)生的高級醇如異戊醇、異丁醇、苯乙醇等屬于醇甜和助香劑的主要 物質(zhì)來源，賦予白酒一定魅力，如果白酒中無高級醇則無傳統(tǒng)白酒的固有風(fēng)味。
[0004] 異戊醇具有蘋果白蘭地香氣，同時也是我國GB2760-86規(guī)定為允許使用的食用香 料，主要用以配制蘋果和香蕉型香精，因此對形成酒的風(fēng)味和促使酒體豐滿、圓潤、口感細(xì) 膩柔和起著重要作用。
[0005] 醬香型白酒香味的形成與酵母關(guān)系密切，近些年來，從各地優(yōu)質(zhì)白酒酒曲、酒醅中 分離出白酒生產(chǎn)功能微生物，并探討其應(yīng)用。
[0006]目前用于產(chǎn)異戊醇類的菌株主要為釀酒酵母、魯氏酵母、生香酵母等，而扣囊腹膜 酵母產(chǎn)異戊醇類物質(zhì)的研究較少，沒有相關(guān)的文章或?qū)＠?br>[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)異戊醇的扣囊復(fù)膜酵母FBKL2. 0094。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供該囊復(fù)膜酵母FBKL2. 0094在產(chǎn)異戊醇中的用途 一種囊復(fù)膜酵母 FBKL2. 0094/YZwJi供FBKL2. 0094)，其形態(tài) 特征：該菌形成的菌落在PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2d，菌落直徑3~5 mm，菌落圓形塹狀， 顏色白色，質(zhì)地呈短絨毛狀，不透明，菌落邊緣呈齒蝕狀，菌落易挑起。細(xì)胞為卵圓形，細(xì)胞 2. 35~3. 97 μ m，長4. 66~5. 42 μ m，能形成假菌絲及產(chǎn)子囊孢子。
[0010] 該菌種已于2015年6月17日保藏到中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地 址：中國武漢武漢大學(xué))，保藏號：CCTCC NO :M 2015382,名稱：扣囊復(fù)膜酵母 FBKL2. ^^\{Saccharomycopsis fibuligera FBKL2. 0094) 〇
[0011] 本發(fā)明的一種扣囊復(fù)膜酵母 FBKL2. 0094 /YZwJi供ra FBKL2. 0094)的分離，包括以下步驟： (一）對扣囊復(fù)膜酵母 FBKL2. 0094 /YZwJi供FBKL2. 0094)的分 離： 從貴州某酒廠酒曲中，稱取20g大曲及糟醅樣品放入盛180ml無菌水并帶有玻璃珠的 三角燒瓶中，振蕩約30min。取Iml樣品懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋分別由10-4、10-5、10-6 和10-7稀釋度的樣品懸液中各取0. 2ml涂布于分離培養(yǎng)基上，28°C靜止培養(yǎng)2d，挑取單 菌落進(jìn)一步分離篩選純化，斜面培養(yǎng)基上保藏。
[0012] (二）培養(yǎng)基： 鑒定培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基，蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂 (MgSO4 · 7Η20)(λ 5g，瓊脂 20g，氯霉素 (λ lg，1/3000 孟加拉紅溶液 100mL，蒸餾水 1000mL。
[0013] 保藏培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，麥芽膏粉130g/L，氯霉素0. lg/L，瓊脂15/ L, PH5. 8-6. 2 〇
[0014] 固體發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱麥粒培養(yǎng)基 小麥1:1粉碎，高粱3:1粉碎，高粱：小麥質(zhì)量比為1:1混料；90°C熱水潤糧4h (加水 量40% - 50%);燒杯盛裝放入滅菌鍋內(nèi)121°C蒸煮20min ;待混料冷卻到60°C左右加入糖化 酶（200u/g)，調(diào)節(jié)pH4 - 4. 5,在60°C水浴鍋糖化4h ;裝瓶，滅菌。
[0015] (三）菌種的保種和傳代： 1.菌種保藏培養(yǎng)基： (1)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽膏粉130g/L，氯霉素0· lg/L，瓊脂15g/L，PH5. 8 - 6. 2， 115°C滅菌 20min。
[0016] (2)YEro (YPD)培養(yǎng)基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水 1000ml，ρΗ6· 0, 115Γ 滅菌 20min。
[0017] 2.保存方法有4種： (1)傳代培養(yǎng)酵母菌種保存法：將酵母接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置溫箱28°C 培養(yǎng)2d后，將橡膠塞用滅菌固體石蠟熔封，移至4°C冰箱保存，一般酵母在4°C冰箱內(nèi)可以 保存一個月，需定期移植。（2)砂土管酵母菌種保存法：取清潔的海沙，用lmol/L的氫氧 化鈉溶液清洗，然后再用lmol/L的鹽酸溶液清洗，在后用流水沖洗。分裝試管，約2-3厘米 深，干熱滅菌，加入酵母培養(yǎng)液ImL左右與砂土混勻，置真空干燥管內(nèi)干燥，待完全干燥后 熔封保存。
[0018] (3)真空冷凍干燥酵母菌種保存法：將待保存的微生物細(xì)胞或者孢子懸浮在合適 的保護(hù)劑中，預(yù)先將細(xì)胞冷凍，使水凍結(jié)，然后在真空條件下，使冰升華以除去大部分水，殘 留的一些不凍結(jié)的水分，再通過蒸發(fā)從細(xì)胞中除去。
[0019] (4)液體石蠟法：亦稱礦物油保藏法，將酵母菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最 適條件下培養(yǎng)至待得到健壯的菌體后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放 置于低溫（4~6°C)干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法，是定期移植保藏法的輔助方法。
[0020] (四）菌種的生態(tài)特征： 該菌形成的菌落在PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2d，菌落直徑3~5 mm，菌落圓形塹狀， 顏色白色，質(zhì)地呈短絨毛狀，不透明，菌落邊緣呈齒蝕狀，菌落易挑起。細(xì)胞為卵圓形，細(xì)胞 2. 35~3. 97 μ m，長4. 66~5. 42 μ m，能形成假菌絲及產(chǎn)子囊孢子。PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一 周后，菌絲白色，菌落平坦，繩狀，邊緣羊毛狀，兩周后菌絲變?yōu)橄笱傈S，有水果香味。顯微鏡 觀察發(fā)現(xiàn)菌絲容易染色，生殖菌絲直徑2-4um，菌絲有隔膜，且多分支，菌絲系統(tǒng)為一體系至 二體系，生殖菌絲具簡單分隔，顯微鏡觀察，菌絲著色深，均勻，且分支多，呈網(wǎng)狀，有隔膜， 且所有菌絲在Melzer試劑中無變色反應(yīng)，在棉藍(lán)試劑中厚壁菌絲有中度嗜藍(lán)反應(yīng)，菌絲均 勻，分支多，呈網(wǎng)狀，粗壯；而在CA培養(yǎng)基上，菌絲稀疏，白色，質(zhì)地呈繩狀，無味。
[0021] (五）菌種的培養(yǎng)特性 (1) 培養(yǎng)溫度20°C~30°C，最適溫度28°C~30°C ; (2) 培養(yǎng)pH 3~L 5,最佳范圍為4. 5~5.0。
[0022] 細(xì)胞為卵圓形，細(xì)胞2. 35~3.97 μπι，長4. 66~5.42 μπι，有假菌絲及產(chǎn)子囊 孢子，根據(jù)《酵母菌的特征及鑒定手冊》，從樣品中經(jīng)篩菌、分離、純化、鏡檢、生理生化 以及采用16S rDNA測序，將測得序列在DNAMN軟件中進(jìn)行序列反轉(zhuǎn)，在NCBI中進(jìn)行 BLAST比對，再用MEGA5軟件建立所分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定所分離的菌株為扣囊腹 膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera)，故將命名為 FBKL2. fibuligera FBKL2. 0094)〇
[0023] 本發(fā)明的扣囊復(fù)膜酵母菌 FBKL2. 0094 /YZwJigera FBKL2. 0094)對溫度、pH等自然環(huán)境條件的適應(yīng)范圍廣，對不良環(huán)境的耐受力強(qiáng)，容易培養(yǎng) 和保存及工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，不破壞生態(tài)平衡。
[0024]
【具體實施方式】
[0025] -種扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera)的分離方法，包括以下步 驟： a、菌種的分離：從貴州珍酒釀酒有限公司的酒曲中，稱取20g大曲樣品放入盛180ml 無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振蕩約30min。取Iml樣品懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋分 別由10-4、10-5、10-6和10-7稀釋度的樣品懸液中各取0. 2ml涂布于分離培養(yǎng)基上，28°C 靜止培養(yǎng)2d，挑取單菌落進(jìn)一步篩選，斜面培養(yǎng)基上保藏。
[0026] b、菌種的保種和傳代： 1.菌種保藏培養(yǎng)基： (1)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽膏粉130g/L，氯霉素0· lg/L，瓊脂15g/L，PH5. 8 - 6. 2， 115°C滅菌 20min。
[0027] (2) YEro (YPD)培養(yǎng)基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水 1000ml，ρΗ6· 0, 115Γ 滅菌 20min。
[0028] 2.保存方法： (1)傳代培養(yǎng)酵母菌種保存法：將酵母接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置溫箱28°c 培養(yǎng)2d后，將橡膠塞用滅菌固體石蠟熔封，移至4°C冰箱保存，一般酵母在4°C冰箱內(nèi)可以 保存一個月，需定期移植。（2)砂土管酵母菌種保存法：取清潔的海沙，用lmol/L的氫氧 化鈉溶液清洗，然后再用lmol/L的鹽酸溶液清洗，在后用流水沖洗。分裝試管，約2-3厘米 深，干熱滅菌，加入酵母培養(yǎng)液ImL左右與砂土混勻，置真空干燥管內(nèi)干燥，待完全干燥后 熔封保存。
[0029] (3)真空冷凍干燥酵母菌種保存法：將待保存的微生物細(xì)胞或者孢子懸浮在合適 的保護(hù)劑中，預(yù)先將細(xì)胞冷凍，使水凍結(jié)，然后在真空條件下，使冰升華以除去大部分水，殘 留的一些不凍結(jié)的水分，再通過蒸發(fā)從細(xì)胞中除去。
[0030] (4)液體石蠟法：亦稱礦物油保藏法，將酵母菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最 適條件下培養(yǎng)至待得到健壯的菌體后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放 置于低溫（4~6°C)干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法，是定期移植保藏法的輔助方法。
[0031] c、產(chǎn)香能力測定： (1) 種子液制備：配制液體培養(yǎng)基，三角瓶盛裝，115°c滅菌20min，然后在超凈工作臺 接入活化的菌種到液體培養(yǎng)基中，在28°C搖床上培養(yǎng)48h，得種子液； (2) 三角瓶固態(tài)發(fā)酵：采用高粱麥粒培養(yǎng)基，小麥1:1粉碎，高粱3:1粉碎，再以高粱： 小麥質(zhì)量比為1:1混料；接著90°C熱水潤糧4h，其中加水量50% ;將培養(yǎng)基盛裝放入滅菌鍋 內(nèi)121°C蒸煮20min ;待培養(yǎng)基冷卻到60°C加入糖化酶（250u/g)，調(diào)節(jié)pH4. 0-4. 5,在60°C 水浴鍋糖化4h ;裝瓶，滅菌；滅菌完成待培養(yǎng)基冷卻至40°C后，往三角瓶中接入質(zhì)量百分比 為8%的種子液，攪拌均勾，在28"€下丨旦溫培養(yǎng)7d，以后每隔12h扣瓶一次； (3) 產(chǎn)香分析：發(fā)酵結(jié)束進(jìn)行感官評定，香味較濃，可接受性高，再通過氣質(zhì)（GC-MS)聯(lián) 用儀，以上述用扣囊腹膜酵母發(fā)酵出的發(fā)酵樣品做氣質(zhì)分析樣品，并對其中的易揮發(fā)性物 質(zhì)進(jìn)行分析，得出峰圖，結(jié)果表明其中異戊醇類物質(zhì)含量為16. 3% (見表1)。
[0032] 表1發(fā)酵樣品GC-MS成分分析

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未 脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等 同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種扣囊復(fù)膜酵母FBKL2. 0094，其特征在于所述菌種的保藏號為CCTCC NO :M 2015382,名稱：扣囊復(fù)膜酵母 FBKL2. 0094 /iAWigera 2. 0094)。2. 如權(quán)利要求1所述的囊復(fù)膜酵母FBKL2. 0094在產(chǎn)異戊醇中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種扣囊復(fù)膜酵母及其用途，其形態(tài)特征：該菌形成的菌落在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2d，菌落直徑3～5mm，菌落圓形埑狀，顏色白色，質(zhì)地呈短絨毛狀，不透明，菌落邊緣呈齒蝕狀，菌落易挑起。細(xì)胞為卵圓形，細(xì)胞2.35～3.97μm，長4.66～5.42μm，能形成假菌絲及產(chǎn)子囊孢子。本發(fā)明能在醬香型白酒中產(chǎn)異戊醇。CCTCC NO：M201538220150617
【IPC分類】C12R1/645, C12P7/04, C12N1/16
【公開號】CN105062904
【申請?zhí)枴緾N201510636469
【發(fā)明人】王曉丹, 周鴻翔, 邱樹毅, 羅小葉
【申請人】貴州大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月30日