一種高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株及其選育方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物菌種選育的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株及其選育方法與應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002]紅曲霉菌，作為一種絲狀真菌，屬于真菌界、子囊菌門、子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科。紅曲色素是由紅曲霉菌次級代謝產(chǎn)生的一系列聚酮類化合物的天然色素，在中國、韓國和日本一直被作為食品添加劑廣泛用于飲料、醬、食用油、面包、糕點(diǎn)等領(lǐng)域，已有上千年歷史。目前商品用紅曲色素一般為混合色素，主要分為紅、橙、黃三大類。由于紅曲霉液態(tài)發(fā)酵的紅曲色素主要是胞內(nèi)色素，這些色素易溶于乙醇、丙酮等極性較大的有機(jī)溶液，都是非水溶性的色素，因此在食品應(yīng)用方面受到一定的限制。
[0003]近年來，除了作為食用著色劑以外，有研究報(bào)道兩種紅曲黃色素，包括紅曲素(monascin)和安卡紅曲黃素(ankaflavin)，是降脂的有效成分，能顯著降低血清TC、TG、低密度脂蛋白和膽固醇的水平；紅曲黃色素monaphilone A和monaphilone B對人體喉癌細(xì)胞株(HEp-2)、人結(jié)腸癌細(xì)胞株(WiDr)有抗增殖作用，且在一定劑量下(70uM)對人肺部成纖維細(xì)胞系無明顯毒性(J Agric Food Chem，2010，58(14):8211-8216.)，應(yīng)用市場巨大。但目前紅曲黃色素絕大部分都是胞內(nèi)脂溶性黃色素，生產(chǎn)工藝較復(fù)雜，且不利于在水溶性場合使用。生產(chǎn)中通常采用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，改變其結(jié)構(gòu)及發(fā)色性能成為水溶性色素，但是嚴(yán)格來說，轉(zhuǎn)化后成為非天然色素，其使用受到了一定的質(zhì)疑和限制。故選育一種高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株對天然胞外紅曲黃色素的生產(chǎn)及應(yīng)用具有直接現(xiàn)實(shí)的重要意義和價(jià)值。
[0004]微生物對生存條件變化的適應(yīng)能力是菌株選育的很好途徑，外界環(huán)境的變化，能使微生物群體特性發(fā)生相應(yīng)的變異。紫外誘變是傳統(tǒng)的微生物菌種選育方法，其主要生物學(xué)效應(yīng)是由于DNA變化而造成的，DNA對紫外線有強(qiáng)烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更敏感。紫外線引起DNA結(jié)構(gòu)變化，使得DNA鏈的斷裂、堿基破壞，最主要的作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。紫外線的波長一般在200-380nm之間，但最有效的誘變波長是252_265nm，通過對紅曲生產(chǎn)菌株的紫外誘變，改變生產(chǎn)菌株的生理性狀，從而篩選高產(chǎn)紅曲胞外黃色素的生產(chǎn)菌株，是一種篩選改良菌種有效的技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)在菌種的缺點(diǎn)與不足，提供一種高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供所述高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株的選育方法。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供所述高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株，名稱為紅色紅曲霉(Monascus ruber) WQ15，保藏編號為CGMCC N0.10910，于2015年7月2日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0009]所述高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株的形態(tài)如下:在PDA平板上培養(yǎng)7天，菌落形態(tài)較大，直徑30.8?31.8mm，菌落呈黃褐色，背面呈橙黃色；菌落邊緣完整，圓潤；中心凸起成丘陵?duì)?，無輻射裂紋，有白色絨毛狀氣生菌絲生長；周圍光滑發(fā)亮，無油滴狀物質(zhì)；菌絲光滑，透明無色，有隔；分生孢子呈球形或倒梨，單生或成鏈；閉囊殼較大，球形，囊內(nèi)孢子可見，橢圓形。
[0010]所述高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株的選育方法，包含以下步驟:
[0011](I)孢子懸浮液制備:出發(fā)菌株接種于PDA培養(yǎng)基斜面上，在28?30°C培養(yǎng)2?3d后，用生理鹽水沖洗菌種斜面，經(jīng)玻璃珠打散，去除菌絲，得到含有孢子的懸浮液；
[0012](2)紫外誘變:將步驟⑴得到的含有孢子的懸浮液置于平底培養(yǎng)皿中，在15W紫外燈垂直距離下30cm放置，同時(shí)磁力攪拌照射一定時(shí)間，進(jìn)行紫外誘變；
[0013](3)平板分離篩選:接著將步驟⑵誘變后的懸浮液稀釋后涂布于PDA平板，28?30°C恒溫避光倒置培養(yǎng)，待長出菌落后，挑選出菌落形態(tài)發(fā)生變化的菌株，進(jìn)行單菌落劃線分離，經(jīng)反復(fù)分離純化得到較純的誘變菌株；
[0014](4)發(fā)酵選育:
[0015]①種子液的制備:將步驟(3)純化后得到的誘變菌株接種于滅菌的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖，每50mL種子培養(yǎng)基接種3?5個(gè)培養(yǎng)4_7天的單菌落，150?200rpm培養(yǎng)28?32h，使種子培養(yǎng)基有成熟的孢子，得到種子液；
[0016]②發(fā)酵培養(yǎng)及高糖純化:將種子液按8%接種量(V/V)接種到25mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)2?4天，然后加入葡萄糖直至糖濃度達(dá)到300g/L以上，再培養(yǎng)直至10?16天，離心、抽濾，得到含胞外紅曲色素的上清液，檢測胞外色素的色價(jià)和色調(diào)，得到高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株。
[0017]步驟(I)中所述的去除菌絲優(yōu)選為通過4層無菌擦鏡紙濾去菌絲。
[0018]步驟⑴中所述的含有孢子的懸浮液中孢子的濃度優(yōu)選為I X 15個(gè)/mL。
[0019]步驟(I)中所述的出發(fā)菌株優(yōu)選為紅曲霉菌株Monascus ruber GIM3.240。
[0020]步驟(3)中所述的菌落形態(tài)包括菌落大小、顏色和氣生菌絲等。
[0021]步驟(3)中所述的純化的操作如下:將菌落劃線于PDA平板上培養(yǎng)，直至從同一菌落上劃出來得到的菌落形態(tài)類似。
[0022]所述的PDA培養(yǎng)基的組成為:馬鈴薯浸粉0.06g，葡萄糖0.4g，瓊脂粉0.3g，用蒸饋水定容至20mL，pH自然。
[0023]步驟(4)中所述的種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖lg，酵母浸粉0.15g，魚粉蛋白胨0.5g，KCl 0.025g，KH2PO40.2g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.5mg，用蒸餾水定容至 50mL，pH 自然。
[0024]步驟⑷中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖1.25g，(NH4) 2S040.125g，KH2PO40.125g，MgSO4.7H20 0.0125g，KCl 0.0125g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.25mg，ZnSO4.7H200.25mg，MnSO4.H2O 0.75mg，用蒸饋水定容至 25mL，pH 自然。
[0025]所述高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株特別適合用于生產(chǎn)紅曲黃色素。
[0026]所述高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株用于生產(chǎn)紅曲黃色素，優(yōu)選包括如下步驟:
[0027]1、將所述高產(chǎn)胞外黃色素的紅曲霉菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行好氧發(fā)酵，使得紅曲霉菌處于對數(shù)生長期或穩(wěn)定期；
[0028]I1、接著補(bǔ)加碳源，該碳源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為至少60g/L，繼續(xù)好氧發(fā)酵；
[0029]II1、將發(fā)酵好的發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，取液體，得到胞外水溶性紅曲黃色素。
[0030]步驟(I)中所述的基本發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下??每10mL基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，含葡萄糖 5g、(NH4)2SO40.5g、KH2PO40.5g、KCl 0.05g、MgSO4.7Η200.05g、FeSO4.7H20 1.0mg、ZnSO4.7H20 1.0mg、MnSO4.H2O 3.0mg，用蒸餾水定容至 100ml，pH 自然。
[0031]步驟(I)中所述的紅曲霉菌株在接種于發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選為將紅曲霉菌進(jìn)行活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后再接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0032]所述的活化為常規(guī)的手段，如將紅曲霉菌種劃線于平板中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0033]所述的擴(kuò)大培養(yǎng)為常規(guī)的手段，具體操作如下:從活化好的紅曲霉菌從平板上接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖，每50mL種子培養(yǎng)基接種3?5個(gè)培養(yǎng)4_7天的單菌落、27?34°C、150?250rpm培養(yǎng)24?32h，使種子培養(yǎng)基有成熟的孢子，得到種子液。