一種利用真菌發(fā)酵制備漆酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用真菌發(fā)酵制備漆酶的方法。 技術(shù)背景
[0002] 漆酶（laccase,EC. 1. 10. 3. 1)屬于多酸氧化酶（Polyphenoloxidase，PP0)，是一 類含銅的氧化還原酶，是在細(xì)菌、真菌、植物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)都廣泛存在的一類銅蛋白，并 具有廣泛的作用底物。多酚氧化酶能有效地催化多酚類化合物氧化形成相應(yīng)的醌類物質(zhì)， 在含酚廢水處理、木質(zhì)素降解以及染料脫色等領(lǐng)域得到較好的研究和應(yīng)用。新鮮茶葉細(xì)胞 中富含多酚氧化酶，能促使兒茶素類物質(zhì)氧化形成茶黃素、茶紅素和其他氧化聚合物等，產(chǎn) 生香氣化合物，是形成紅茶風(fēng)味和特質(zhì)的生化基礎(chǔ)。因此，多酚氧化酶在茶樹(shù)生理代謝及茶 葉加工等過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用。
[0003] 茶是三大無(wú)酒精飲料之一。大量研究發(fā)現(xiàn)飲用茶水除具有益思少睡、助消化、明目 利尿等功效外，還有預(yù)防心血管病、糖尿病和抗癌等作用。隨著茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，特別是速溶 茶和液態(tài)茶飲料的生產(chǎn)，僅僅依靠傳統(tǒng)茶葉生產(chǎn)工藝已滿足不了生產(chǎn)的需要。高附加值茶 產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)，特別是酶工程技術(shù)將逐漸應(yīng)用于茶葉加工中。目前，已有單寧酶、纖維素酶、 多酚氧化酶和蛋白酶等酶制劑應(yīng)用于茶葉加工。
[0004] 本發(fā)明的特征在于利用茶葉（或茶水）作為主要的培養(yǎng)基成分，通過(guò)真菌發(fā)酵生 產(chǎn)一種漆酶，該漆酶對(duì)茶水成分有一定的生物轉(zhuǎn)化作用，有望應(yīng)用于茶葉深加工生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用真菌發(fā)酵制備漆酶的方法。將菌株接種于培養(yǎng)基 中，發(fā)酵培養(yǎng)后獲得含有漆酶的發(fā)酵液，將該發(fā)酵液經(jīng)過(guò)分離純化即獲得漆酶。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的而采用技術(shù)方案如下： 1、 以終體積為1L的發(fā)酵培養(yǎng)基水溶液計(jì)，其各組份的配方為： 麩皮 30.0~35.0g 茶葉 6.0~10.0g 蛋白胨 2.5~4,0g KH：P〇4 2.0~3.0g MgS0_, * 7H20 (12 ~0.5g MnS04 ? 5H；.0 0.45-0.55g CuS04 ? 5H20 0.0 卜-0_02g 2、 具體制備步驟： (1)在每個(gè)250mL三角瓶中裝入上述發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為60mL，按常規(guī)方法滅菌。
[0007](2)在每個(gè)三角瓶中接入冠突散囊菌孢子懸浮液2mL，在溫度26~28°C，轉(zhuǎn)速 120r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)3~4天后，取發(fā)酵液經(jīng)紗布過(guò)濾、離心獲得上清液即為粗酶 液。
[0008] 所述的冠突散囊菌孢子懸浮液，其濃度為1~2X10s個(gè)孢子/mL。
[0009] (3)粗酶液依次經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-纖維素陰離子交換柱層析和葡聚糖 G-150凝膠層析，即得到分離純化的漆酶。
[0010] 所述的硫酸銨分級(jí)沉淀，是指將制備好的粗酶液置于冰水浴中，緩慢加入研磨好 的硫酸銨至飽和度50%，靜置2h，10000r/min，4°C離心lOmin，取上清液；在上清液中繼續(xù) 加硫酸銨至飽和度80%，靜置12~1811，1000(^/1^11，4°(：離心101^11，收集沉淀 ；用適量的 pH6. 0、0? 05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，然后置于透析袋中，在pH6. 0、0? 05mol/ L醋酸-醋酸鈉緩沖液于4°C條件下透析脫鹽，更換緩沖液2-3次，透析結(jié)束后，測(cè)定酶活力 和蛋白質(zhì)含量，凍干濃縮。
[0011] 所述的DEAE-纖維素陰離子交換柱層析，是指先將干粉的纖維素浸泡在蒸餾水 中，充分溶脹后，去除雜質(zhì)，用0. 5mol/L的HC1溶液浸泡2h，用超純水洗凈至pH中性，再 浸泡在〇? 5mol/L的NaOH溶液中2h，用超純水水洗至中性后，再用pH6. 0、0? 05mol/L醋 酸-醋酸鈉緩沖液平衡，進(jìn)行裝柱，壓實(shí)后靜置12~15h;把柱子與層析儀連接起來(lái)，流速 為0. 8mL/min，先用pH6. 0、0. 05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡凝膠一段時(shí)間，直到基線 平穩(wěn)，將硫酸銨沉淀凍干濃縮后的酶液進(jìn)行上樣，用1~1. 5mol/LNaCl、pH6. 0、0? 05mol/ L醋酸-醋酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，用10mL的管收集，每管收集4mL，檢測(cè)各管的酶活，透析脫 鹽，凍干濃縮，得到凍干的酶粉末，并于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0012] 所述的葡聚糖G-150凝膠層析，是指將凍干的酶粉末，用pH6. 0、0. 05mol/L醋 酸-醋酸鈉緩沖液溶解，l〇〇〇〇r/min，4°C離心lOmin，取上清液待用；取適量的葡聚糖G-150 粉末，加入超純水中，沸水浴溶脹5~6h，除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用超純水反復(fù)洗滌 2~3次，再以pH6. 0、0. 05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液洗滌2-3次，進(jìn)行裝柱，壓實(shí)后過(guò) 夜，把柱子與層析儀連接起來(lái)，流速為0. 4mL/min，先用pH6. 0、0. 05mol/L醋酸-醋酸鈉緩 沖液平衡凝膠一段時(shí)間，直到基線平衡，取樣品上樣，緩沖液洗脫，用10mL的管收集，每管 收集4mL，得到漆酶，檢測(cè)各管漆酶的酶活，凍干濃縮，-20°C保存。
[0013] 本發(fā)明所述的冠突散囊菌孢子懸浮液，其濃度為1~2X10s個(gè)孢子/mL，配制過(guò)程 如下：將冠突散囊菌的菌株接種到新鮮PDA培養(yǎng)基的平板上，在溫度26~28°C條件下培養(yǎng) 5d得到成熟孢子，用無(wú)菌蒸餾水洗下孢子，放入裝有無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩。待 孢子充分打散后，測(cè)孢子懸浮液0D600的值，并用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整其0D值至2. 0,即得孢 子懸浮液。
[0014] 本發(fā)明所述的冠突散囊菌（Eurotiumcristatum)，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏 管理中心（CGMCC)，其編號(hào)為：3.07934。使用前冠突散囊菌（Eurotiumcristatum)于4°C 條件下保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上。
[0015] 采用本發(fā)明所述的方法制備漆酶過(guò)程中，經(jīng)葡聚糖G-150凝膠層析獲得的漆酶， 經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，漆酶相對(duì)分子質(zhì)量為70kDa。SDS-PAGE條件：分離膠濃度為 12 %，濃縮膠濃度為5 %。電壓在80-120V電泳2h，電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染 色劑染色lh，后用30%甲醇和10%冰醋酸脫色2h。
[0016] 所述的SDS-PAGE配制見(jiàn)下表：
采用本發(fā)明所述的方法，優(yōu)化了漆酶生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)條件，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，漆 酶的純化倍數(shù)達(dá)到8. 98,回收率為24. 88%，酶活達(dá)到2413U/L。
[0017] 本發(fā)明的創(chuàng)新在于利用茶葉作為主要成分之一發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，發(fā)展了茶葉利用 的新途徑，對(duì)低檔次茶葉和茶葉生產(chǎn)過(guò)程中廢棄物利用有較好的指導(dǎo)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是實(shí)施例1中測(cè)定粗酶液比活力所用到的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0019] 圖2是實(shí)施例1中利用硫酸銨分級(jí)沉淀確定硫酸銨飽和度的曲線圖。
[0020] 圖3是實(shí)施例1中測(cè)定經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀后酶液比活力所用到的的牛血清蛋白 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0021] 圖4是實(shí)施例1制備得到的粗酶液經(jīng)DEAE-纖維素陰離子交換層析圖譜。
[0022] 圖5是實(shí)施例1制備得到的粗酶液經(jīng)葡聚糖G-150凝膠層析后的圖譜。
[0023] 圖6是實(shí)施例1制備得到、分離純化后的漆酶酶液進(jìn)行SDS-PAGE的電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】： 為了對(duì)本發(fā)明更好的理解，現(xiàn)結(jié)合附圖以實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0025] 圖1中，測(cè)得粗酶液漆酶酶活為2470U/L;用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗酶液蛋白含量， 得粗酶液中總蛋白為47. 44mg，粗酶液比活力為10. 41U/mg。
[0026] 圖2中，將粗酶液用不同飽和度的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀，對(duì)各個(gè)飽和度下酶液的 上清液離心后，進(jìn)行酶活測(cè)定。從圖2可知，硫酸銨飽和度在20%~50%之間，上清液酶 活基本上保持不變，說(shuō)明此時(shí)沉降下來(lái)的蛋白質(zhì)是雜蛋白；硫酸銨飽和度由50%到80%， 上清液中酶活急劇下降，酶活只剩余5%左右，說(shuō)明此時(shí)大部分漆酶在硫酸銨作用下已經(jīng)沉 淀。因此，把50 % -80 %硫酸銨飽和度確定為漆酶分級(jí)沉淀的范圍。
[0027] 圖3中，酶粗液先用50%飽和度的硫酸銨去除雜蛋白，然后添加硫酸銨，使硫酸銨 的飽和度達(dá)到80%。收集50 %~80 %硫酸銨飽和度的沉淀，用pH6. 00. 05mol/L醋酸-醋 酸鈉溶解沉淀，在4°C冰箱透析過(guò)夜，并更換緩沖液3次，用BaCl2檢測(cè)S0 42+是否透析完全， 透析完后，并測(cè)定酶活力和蛋白質(zhì)含量，漆酶酶活為17. 26U/mL，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗酶 液蛋白含量，得粗酶液中總蛋白為6. 76mg，粗酶液比活力為25. 53U/mg。
[0028] 圖4中，儀器檢測(cè)出有兩個(gè)蛋白峰，第一個(gè)蛋白峰比較小，當(dāng)NaCl濃度為50%時(shí)， 出現(xiàn)第二個(gè)蛋白峰。經(jīng)過(guò)酶活檢測(cè)后，漆酶在第二個(gè)蛋白峰內(nèi)，第一個(gè)蛋白峰內(nèi)沒(méi)有酶活， 說(shuō)明第一個(gè)蛋白峰是雜蛋白峰。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗酶液蛋白含量，得粗酶液中總蛋白 為1. 17mg，粗酶液比活力為100. 43U/mg。
[0029] 圖5中，層析儀檢測(cè)到一個(gè)明顯的洗脫峰，測(cè)得漆酶酶活為10. 15U/mL，用考馬斯 亮藍(lán)法測(cè)定粗酶液蛋白含量，得粗酶液中總蛋白為0. 6mg，粗酶液比活力為135. 3U/mg。
[0030] 圖6中，將分離純化最后一步得到的漆酶酶液進(jìn)行SDS-PAGE純度檢測(cè)，得到單一 蛋白條帶，其分子量大小在70kDa左右。圖中M:蛋白Marker;1:葡聚糖G-150凝膠層析； 2 :凍干濃縮后粗酶液。
[0031] 在實(shí)施例中涉及的試劑配制： 1)考馬斯亮藍(lán)6-250:稱取10011^考馬斯亮藍(lán)6-250溶于501^90%乙醇中，加入85% (W/V)磷酸100mL，最后用超純水定容至1000mL，此溶液在常溫下可放置一個(gè)月。
[0032] 2)牛血清蛋白（BSA)配制：取O.Olg牛血清蛋白，加入20mL超純水中，定容到 100mL〇
[0033] 3)5XGlycine-TrisBuffer:分別稱取Gly94g、Tris15.lg和SDS5g，加 800mLddH20溶解，定容至1L。
[0034] 4) 10% (W/V)過(guò)硫酸銨（APS)的配制：稱取lg過(guò)硫酸銨加入8mLddH20將固體粉 末徹底攪拌溶解，定容至10mL并貯存于4°C。
[0035] 5) 30%丙稀酰胺溶液：將29g丙稀酰胺（Acylamide)和lgN，N'-亞甲雙丙稀酰 胺（Bis)于總體積為60mL的ddH20中。加熱至37°C溶解，補(bǔ)加水至終體積為100mL。用濾 器（0. 45ym孔徑）過(guò)濾除