靈芝高產(chǎn)菌株選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物的發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種靈芝高產(chǎn)菌株選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，不管是在實(shí)驗(yàn)室的研究或者工廠工業(yè)化生產(chǎn)過程中，發(fā)酵產(chǎn)業(yè)尤其是絲狀 真菌發(fā)酵都是一個(gè)操作復(fù)雜，穩(wěn)定性較差的生產(chǎn)方式，主要存在菌種保存過程中活力會(huì)逐 漸降低、菌種傳代過程中也會(huì)隨傳代次數(shù)增加而顯著降低、菌種突變率高(運(yùn)些突變中生長(zhǎng) 能力減弱和次級(jí)代謝產(chǎn)物的降低往往占據(jù)了突變的絕大部分比重）等問題，導(dǎo)致很多實(shí)驗(yàn) 研究或者發(fā)酵生產(chǎn)都很難精確預(yù)測(cè)出發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的生長(zhǎng)狀況。而常見的檢測(cè)方法也難W在 短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)論，即便得出結(jié)論需要調(diào)整，也難W在為期數(shù)日的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)對(duì)發(fā)酵結(jié)果 產(chǎn)生明顯的改善，導(dǎo)致發(fā)酵過程控制對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響力就相對(duì)更弱。因此，菌種的質(zhì)量就 成了影響發(fā)酵的十分重要甚至決定性的因素。
[0003] 而目前的菌種選育通常是通過自然突變高產(chǎn)菌株或者人工誘變手段進(jìn)行，往往存 在誘變周期長(zhǎng)，成功率低，工作量大的問題。同時(shí)又導(dǎo)致保存過程繁雜，保存菌株在使用前 又需要冗長(zhǎng)的活化工作，加劇了菌株選育的難度和工作量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了意在提供一種縮短菌株保藏環(huán)節(jié)，降低了菌種活化的培養(yǎng)周期，能大 量篩選出高產(chǎn)靈芝多糖的菌株選育方法。 陽〇化]本發(fā)明提供基礎(chǔ)方案是：靈芝高產(chǎn)菌株選育方法，其操作步驟如下： A、 菌種活化：取韓國短柄赤芝菌種和日本鹿角靈芝菌種，韓國短柄赤芝菌種與日本鹿 角靈芝菌種的比例關(guān)系為1: 1，將兩種菌種用PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基于28°C震蕩培養(yǎng)5~7d; B、 在其中一種菌種的穩(wěn)定期將其接種在PDA復(fù)合培養(yǎng)基中，放置在28Γ的搖床中震蕩 培養(yǎng)4~6d，另一種菌種在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期將其接種在PDA復(fù)合培養(yǎng)基中，放置在28°C的搖床中 震蕩培養(yǎng)2~4d，PDA復(fù)合培養(yǎng)基是在PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)之上加入1. 5%憐酸二氨鐘和 0. 75%硫酸儀； C、 選擇原始高產(chǎn)菌種用于發(fā)酵生產(chǎn)； D、 將步驟C的高產(chǎn)菌種通過四至五代傳代培養(yǎng)，當(dāng)菌種的質(zhì)量下降時(shí)，對(duì)其進(jìn)行外部 刺激， E、 外部刺激：在無菌環(huán)境下，使用20ml勻漿器對(duì)菌液進(jìn)行勻漿處理，再將勻漿后的菌 液按照10%的接種量接種在多個(gè)新的復(fù)合培養(yǎng)液培養(yǎng)； F、 選擇篩選優(yōu)質(zhì)的菌株進(jìn)行擴(kuò)培培養(yǎng)； G、 當(dāng)步驟E中新的復(fù)合培養(yǎng)液中的菌種出現(xiàn)質(zhì)量下降時(shí)，重復(fù)操作步驟E、F。
[0006] 本發(fā)明靈芝高產(chǎn)菌株選育方法，步驟A，韓國短柄赤芝菌種、日本鹿角靈芝菌種的 選擇，從窄義的理解來說，因?yàn)殪`芝科中的一個(gè)品種是赤芝，是常見的代表品種，被人們稱 習(xí)慣了叫靈芝，實(shí)際上它的學(xué)名是赤芝；野生赤芝并不是都有菌柄，有柄或近無柄或無柄； 靈芝菌柄紅褐色至黑色，都有漆樣光澤，堅(jiān)硬；我國是靈芝的故鄉(xiāng)，但目前我國靈芝產(chǎn)業(yè)中 所用的菌種存在著嚴(yán)重的品種退化及質(zhì)量下降等問題，品質(zhì)較高的靈芝種大多依靠從日 本、韓國引進(jìn)，將兩種菌種用PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)將其活化。步驟B，通過不同生長(zhǎng)階段 和不同菌株種群之間在共同生長(zhǎng)環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)性作用，自然激發(fā)其生長(zhǎng)能力，從而有更高 的幾率培養(yǎng)出高產(chǎn)混合菌株。步驟C，對(duì)混合菌種生長(zhǎng)能力進(jìn)行進(jìn)一步擇優(yōu)篩選，從而獲得 原始高產(chǎn)母種用于發(fā)酵生產(chǎn)。步驟D，對(duì)高產(chǎn)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌種質(zhì)量下降時(shí)，采取外 部刺激的方式達(dá)到選擇優(yōu)質(zhì)菌株的目的。步驟E，外部刺激操作的目的在于打破原有菌球形 態(tài)，將過大的細(xì)胞勻漿破裂死亡，留下活力較好的體積較小的新生細(xì)胞和抱子，使破碎的大 細(xì)胞中的生物活性大分子釋放出來，刺激或供給活力好的細(xì)胞及抱子進(jìn)行生長(zhǎng)，從而達(dá)到 在不重新開始發(fā)酵選育過程的情況下就能夠直接對(duì)菌種進(jìn)行原位處理，同時(shí)在多個(gè)培養(yǎng)容 器中再次進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)驗(yàn)證，從而達(dá)到篩選優(yōu)質(zhì)菌株的目的。步驟F，從中選擇優(yōu)質(zhì)的菌株 進(jìn)行移植擴(kuò)大培養(yǎng)，而其余的菌株則繼續(xù)培養(yǎng)。步驟G，當(dāng)菌種的質(zhì)量出現(xiàn)下降時(shí)，再次外部 刺激選擇優(yōu)質(zhì)的菌種，從而可反復(fù)選擇、保存。
[0007] 本發(fā)明是集"菌種活化"、"菌種保藏"、"菌種誘變"、"菌種篩選"、"菌種傳代保種" 等一系列內(nèi)容為一體的整體實(shí)驗(yàn)體系。相比傳統(tǒng)的菌種"活化-傳代-篩選-保存"方法， 本方法的優(yōu)勢(shì)在于：一是活化過程中不需要多次傳代，從而節(jié)約了大量精力和時(shí)間，能夠隨 時(shí)直接應(yīng)用于生產(chǎn)或者研究；二是保存過程只需要冷藏保種，時(shí)間短，通常是在高產(chǎn)菌株選 育出太多難W用完的情況下進(jìn)行暫時(shí)保存，不存在傳統(tǒng)的保藏操作繁瑣，保存中活力變化 不穩(wěn)定等劣勢(shì)；Ξ是菌種篩選并非盲目的"鳥槍法"，而是更有針對(duì)性進(jìn)行篩選，成功率和高 產(chǎn)獲得率都高于傳統(tǒng)方法(通常在所有選育樣本中有1〇%-15%的幾率出現(xiàn)高產(chǎn)菌株）；四是 傳代過程中出現(xiàn)問題不需要舍棄該菌株，而是直接可W通過操作對(duì)該菌株進(jìn)行處理，刺激 其本身活力恢復(fù)，不需要另外使用保存菌株進(jìn)行活化。
[0008] 進(jìn)一步，所述步驟C中選擇原始高產(chǎn)菌種是選擇細(xì)胞形態(tài)為球型或楠球型，菌絲 蔓延速度>Icm/d，色素產(chǎn)生能力為第2-3d開始產(chǎn)生黃色色素、培養(yǎng)結(jié)束時(shí)為深黃色，靈芝 多糖產(chǎn)量為同批次中最高和胞內(nèi)靈芝多糖為90%W上的菌種。僅是判斷的基本量化選擇， 也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)相對(duì)選擇高產(chǎn)菌種。
[0009] 進(jìn)一步，所述步驟D中當(dāng)菌種的質(zhì)量下降時(shí)的依據(jù)為：培養(yǎng)液中抑值為2. 8-3. 0， 菌體干重低于5g/l，靈芝多糖產(chǎn)率低于20%，靈芝菌球靜置密度為搖瓶靜置后發(fā)酵液總體 積減去上清液后所占體積低于90%，靈芝菌球直徑低于2mm或者高于5mm，多個(gè)靈芝菌球直 徑標(biāo)準(zhǔn)差大于2mm，靈芝菌球表面形態(tài)趨于光滑，外延菌絲長(zhǎng)度低于0. 5mm，菌球顏色趨于 白色或者褐色。僅是基本的量化選擇，也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)相對(duì)判斷菌種的質(zhì)量下降。
[0010] 進(jìn)一步，所述步驟E中勻漿處理的時(shí)間為10~15個(gè)往返。
【附圖說