一種抑制Survivin基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種抑制survivin基因表達(dá)的siRNA分子及其在制備抗腫瘤藥物 的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，惡性腫瘤臨床進(jìn)展快、生存期短以及傳統(tǒng)臨床治療的中遠(yuǎn)期療效均不理想， 化療藥物一方面起到治療作用，同時另一方面，化療藥物的毒副作用對患者的身體起到破 壞作用。因此，因而尋找新的腫瘤治療策略是全球臨床及科研工作者所面臨的重大問題。隨 著分子生物學(xué)的發(fā)展，針對腫瘤基因進(jìn)行靶向治療成為癌癥治療研究的方向。藥物作用于 腫瘤某分子、某基因等靶向部位，一方面提高了療效，另一方面減少了藥物的用量。尋找能 成為腫瘤治療的標(biāo)靶已成為治療腫瘤的前提之一?？赡艹蔀樗幬镒饔玫臉?biāo)靶包括：癌細(xì)胞 具有的特殊的抗原、特殊生長因子受體、腫瘤血管生長相關(guān)因子、癌細(xì)胞特殊信息傳遞途徑 中的各種分子、癌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)控分子。
[0003] 人類survivin基因是1997年美國耶魯大學(xué)的Ambrosini等利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶 受體-1(effectorcellproteasereceptor_l，EPR-l)cDNA在人類基因組的雜交篩選中分 離并克隆出來的，與EPR-1同位于染色體17q25,全長14. 7kb，由3個內(nèi)含子和4個外顯子組 成，其mRNA長約1.9kb，其編碼產(chǎn)生的蛋白由142個氨基酸組成，相對分子量為16. 5X103， 是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族中的一個新 成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞有絲分裂的雙重功能，在正常的終末分化組織中幾乎 不表達(dá)。在生理狀態(tài)下，survivin僅表達(dá)于成人分泌期子宮內(nèi)膜、胎盤、睪丸、胸腺及胚胎 中，但在病理狀態(tài)下，survivin廣泛表達(dá)于人類各種惡性腫瘤組織中，如胃癌、食管癌、結(jié) 直腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、III~IV期神經(jīng)母細(xì)胞瘤等。 survivin表達(dá)增高可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而促進(jìn)其增殖，而且其表達(dá)與病程進(jìn)展明顯相關(guān)。 因此，survivin可能作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，成為檢測惡性腫瘤的指標(biāo)。
[0004] RNA干擾survivin表達(dá)技術(shù)，RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是指在生物體 細(xì)胞內(nèi)，外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double-strandedRNA)引起與其同源的mRNA特異性 的降解，從而抑制survivin基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，具有高度特異性、高效性的特點(diǎn)?？偨Y(jié)近年 來的研究成果，其在臨床應(yīng)用中具有較廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開一種抑制survivin基因表達(dá)的雙鏈siRNA分子其在抗腫瘤藥物的應(yīng) 用，是一種新的siRNA序列，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
[0006] 本發(fā)明所述的雙鏈SiRNA分子，其特征在于，該雙鏈SiRNA分子是一種高效靶向 survivin基因的廣譜雙鏈的小分子干擾RNA (siRNA)，具有如下序列結(jié)構(gòu)：
[0007] 正義鏈 5 ' -GAGACAGAAUAGAGUGAUA-3 'SEQIDN0:1
[0008] 反義鏈 5 ' -UAUCACUCUAUUCU⑶CUC-3 'SEQIDN0:2
[0009] 本發(fā)明所述的雙鏈siRNA分子的主干序列即為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示 的核苷酸序列，即正義鏈和反義鏈分別具有SEQIDN0:1和2所示的核苷酸序列的雙鏈分 子。
[0010] 優(yōu)選的，所述雙鏈SiRNA分子，具有如下的序列結(jié)構(gòu)：
[0011]正義鏈：5 '-GAGACAGAAUAGAGUGAUAtt-3 'SEQIDN0:3
[0012] 反義鏈：5 ' -UAUCACUCUAUUCU⑶CUCtt-3 'SEQIDN0:4。
[0013] 本發(fā)明的siRNA分子來源于針對survivin基因開放閱讀框的功能保守區(qū)而制備 的siRNA分子庫，該序列的正義鏈與survivin基因的mRNA結(jié)合，干擾survivin基因mRNA 的翻譯，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期。
[0014] 本發(fā)明的siRNA分子的優(yōu)點(diǎn)在于，所制備的siRNA隨機(jī)分布于survivin基因開放 閱讀框區(qū)段，長度可控性分布于19-23bp，可以提高有效靶點(diǎn)的命中率。
[0015] 本發(fā)明還提出了一種siRNA重組質(zhì)粒，所述的siRNA重組質(zhì)粒包含前面所述的任 意一種雙鏈siRNA分子的序列。由此，利用siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞，能夠有效的沉默 surivivin基因，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞分裂、抑制腫瘤血管的生成，從而能夠有 效的治療腫瘤。進(jìn)一步，該siRNA分子與siRNA重組質(zhì)粒能夠有效的用于抗腫瘤藥物的制 備，從而利用制備的抗腫瘤藥物對患者進(jìn)行給藥，有效的治療腫瘤。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明還提出了一種survivin基因沉默試劑盒，所述試劑盒包含前面所述 的任意一種雙鏈siRNA分子或siRNA重組質(zhì)粒。利用本發(fā)明的試劑盒能夠有效的將腫瘤患 者的細(xì)胞進(jìn)行survivin基因沉默，從而能夠有效的治療腫瘤。
[0017] 本發(fā)明的siRNA分子可以作為抗腫瘤藥物的有效成分，腫瘤疾病包括如白血病、 胃癌、前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌，乳腺癌，肺癌，肝癌等。
[0018] 因而，本發(fā)明還提出了前面所述的任意一種雙鏈siRNA分子、或者siRNA重組質(zhì)粒 在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明提出一種抗腫瘤藥物，該藥物含有有效量的siRNA分子或siRNA重組質(zhì)粒， 該抗腫瘤藥物可以采用常規(guī)方法制備成相應(yīng)制劑，如可被制成針劑形式，例如用生理鹽水 或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。針劑、溶液等宜在無菌條件下 制造。
[0020] 本發(fā)明的積極效果在于：提供了一種新的高效革E1向survivin基因的廣譜雙鏈的 小分子干擾RNA(siRNA)，同時還公開了其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0021] 圖1是化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞后實(shí)時定量PCR檢測survivinmRNA表達(dá) 量柱形圖，縱坐標(biāo)表示survivin相對于GAPDH的mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示四個處理實(shí)驗 組，分別為未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組，轉(zhuǎn)染實(shí)驗包括三個siRNA濃度，分別為10nM、20nM和30nM。
[0022]圖2是WesternBlot檢測siRNA轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞PC-3、肝癌細(xì)胞IfepG2、乳 腺癌細(xì)胞MCF-7和宮頸癌細(xì)胞Hela后的survivin蛋白表達(dá)量，NC所對應(yīng)的是陰性對照組， EG所對應(yīng)的是加入20nM/孔的siRNA組。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例 只用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 實(shí)施例1 :siRNA沉默效率驗證
[0025] 1.主要儀器、試劑和材料.
[0026] 1. 1儀器：核酸合成儀（GE公司）、PCR儀（ABI公司）；實(shí)時定量PCR(Bio-Rad);細(xì) 胞培養(yǎng)箱（Thermo)等。
[0027]1. 2 材料和試劑：RNAiMAX? (invitrogen)，DMEM培養(yǎng)基（Gibco)，
[0028]TurboCapturemRNAkit(QIAGEN)，SensiMix?one-StepKit(Quantace)等。其 他生化試劑均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
[0029] 1. 3PCR引物（百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成）：
[0030]survivin正向引物：5 ' -AGAACTGGCCCTTCTTGGAGG-3 '
[0031]survivin反向引物：5 ' -CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3 '
[0032]GA