液，D、E兩個(gè)發(fā)酵罐固定用作發(fā)酵液分罐后發(fā)酵(稱(chēng)二級(jí)發(fā) 酵)。
[0013] -個(gè)一級(jí)發(fā)酵罐發(fā)酵至糖化酶酶活線性增長(zhǎng)末期：即發(fā)酵進(jìn)行到118-120小時(shí)的 時(shí)候，將發(fā)酵液各1/3分配到已經(jīng)準(zhǔn)備好新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的D、E二級(jí)發(fā)酵罐中，再?gòu)穆?lián)消器 儲(chǔ)罐分配相當(dāng)于2/3發(fā)酵液體積的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基至只剩下1/3體積發(fā)酵液的該一級(jí)發(fā)酵 罐中，三個(gè)發(fā)酵罐一起進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵，再經(jīng)40-42小時(shí)發(fā)酵后結(jié)束發(fā)酵。結(jié)束發(fā)酵后安排大 約4-8小時(shí)間隔，可用于放罐、發(fā)酵罐清洗、培養(yǎng)基配制及滅菌等準(zhǔn)備工作。該一級(jí)發(fā)酵罐 接種新的種子培養(yǎng)液用于下一輪發(fā)酵；D、E發(fā)酵罐再次與另一個(gè)一級(jí)發(fā)酵罐一起進(jìn)行發(fā)酵 液分割及二級(jí)發(fā)酵。
[0014] D、E發(fā)酵罐每周使用三次，于每周日進(jìn)行一天的清洗和檢修。
[0015] 按照一周一個(gè)循環(huán)的方式安排發(fā)酵，一般可以按以下方式進(jìn)行具體安排。在周一 早晨8點(diǎn)，將上周三早晨接種種子培養(yǎng)液已經(jīng)培養(yǎng)了 5天的A發(fā)酵罐發(fā)酵液各1/3分割到 D、E發(fā)酵罐中，然后與D、E罐一起進(jìn)行分割后的二級(jí)發(fā)酵。發(fā)酵40-42小時(shí)后，至周三凌晨 約2點(diǎn)A罐與D、E罐均達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，一起放罐，放罐后有大約6小時(shí)間隔時(shí)間可用于發(fā)酵 罐清洗、培養(yǎng)基滅菌等工作。周三早晨8點(diǎn)已經(jīng)重新準(zhǔn)備好新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的A罐再次接 入種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)至下周一再次用于下一輪發(fā)酵液分割及二級(jí)發(fā)酵。B發(fā)酵罐發(fā)酵液應(yīng) 該在上一周的周五早晨8點(diǎn)接入種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)至本周三早晨與D、E發(fā)酵罐一起進(jìn)行發(fā) 酵液分割及二級(jí)發(fā)酵，于本周五凌晨約2點(diǎn)與D、E罐一起放罐，然后B發(fā)酵罐于周五早晨8 點(diǎn)再次接種種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)至下周三再次用于下一輪發(fā)酵液分割及二級(jí)發(fā)酵。C發(fā)酵罐發(fā) 酵液應(yīng)該在上一周的周日早晨8點(diǎn)接入種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)至本周五早晨8點(diǎn)用于發(fā)酵液分 割及二級(jí)發(fā)酵，并于本周日凌晨約2點(diǎn)放罐，放罐后C發(fā)酵罐在同一天早晨8點(diǎn)再次接入種 子培養(yǎng)液用于下一輪發(fā)酵，一般是培養(yǎng)至下一周的周五用于發(fā)酵液分割及二級(jí)發(fā)酵。發(fā)酵 罐D(zhuǎn)、E在周日凌晨放罐后可以安排1天的時(shí)間進(jìn)行檢修及準(zhǔn)備工作，下周一上午再次用于 下一循環(huán)的二級(jí)發(fā)酵。
[0016] 按上述方法操作每周7天可以獲得9罐糖化酶發(fā)酵液，平均每天獲得9/7罐。與 此相對(duì)應(yīng)，如果采用原有的發(fā)酵工藝用5個(gè)發(fā)酵罐同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵周期為6天，即使不 計(jì)算發(fā)酵結(jié)束后需要的休整時(shí)間，5個(gè)發(fā)酵罐6天只能獲得5罐發(fā)酵液，平均每天獲得發(fā)酵 液5/6罐。在發(fā)酵液分割新工藝下，結(jié)合使用發(fā)酵罐組合使用方法，單位體積發(fā)酵罐的實(shí)際 發(fā)酵強(qiáng)度可以提高54%。
[0017] 綜上所述，利用黑曲霉GB0506菌株進(jìn)行糖化酶發(fā)酵時(shí)，利用本發(fā)明提供的方法既 可以大幅度提高單位體積發(fā)酵罐生產(chǎn)強(qiáng)度又可以大幅度降低單位發(fā)酵液消耗的電力。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明是針對(duì)黑曲霉GB0506的特殊的發(fā)酵性質(zhì)而建立的，在 使用黑曲霉GB0506進(jìn)行糖化酶發(fā)酵時(shí)，與采用傳統(tǒng)的糖化酶批式發(fā)酵法相比，采用本發(fā)明 提供的方法可以大幅度提高單位發(fā)酵罐體積的發(fā)酵強(qiáng)度，縮短平均單罐發(fā)酵時(shí)間，在生產(chǎn) 同樣數(shù)量糖化酶產(chǎn)品的基礎(chǔ)上節(jié)約電能消耗。本發(fā)明提供的發(fā)酵液分割及發(fā)酵罐組合使用 方法對(duì)其他菌體生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的微生物液體發(fā)酵技術(shù)也有參考意義。
[0019] 生物材料樣品：糖化酶生產(chǎn)菌黑曲霉CICHM F0410、黑曲霉GB0506均由江南大學(xué) 中國(guó)高校工業(yè)微生物資源和信息中心（http://www. cicim-cu. jiangnan. edu. cn)提供。黑 曲霉CKHMF0410、黑曲霉GB0506均為糖化酶生產(chǎn)菌株，在《姚婷婷等.攜多拷貝glaA的 重組黑曲霉過(guò)量合成糖化酶的研究.生物工程學(xué)報(bào)，2006，7, 22 (4): 567-571》已公開(kāi)。 黑曲霉GB0506,申請(qǐng)人保證從申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1黑曲霉GB0506與CICHM F0410的15 L發(fā)酵罐發(fā)酵進(jìn)程比較。
[0021] 圖2黑曲霉GB0506的2噸發(fā)酵罐發(fā)酵進(jìn)程曲線。
[0022] 圖3發(fā)酵液分割時(shí)機(jī)對(duì)分割后發(fā)酵進(jìn)程的影響。
[0023] 圖4 一分三工藝發(fā)酵酶活增長(zhǎng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，實(shí)施例將不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0025] 實(shí)施例1:黑曲霉GB0506的15 L發(fā)酵罐發(fā)酵特點(diǎn) 將糖化酶生產(chǎn)菌黑曲霉CICHM F0410和黑曲霉GB0506接種改良查氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 天，取孢子接種500mL搖瓶種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)2~3d，當(dāng)糖化酶酶活達(dá)到20U/mL時(shí)，按10%接 種量接種二級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)基（1. 5L搖瓶，單瓶裝液量為200mL，共計(jì)5瓶)，培養(yǎng)至酶活約 為100U/mL以上時(shí)按10%接種量接種15L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵罐裝液量為10L)。共進(jìn) 行10次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果兩株菌15L發(fā)酵罐發(fā)酵最高酶活均出現(xiàn)在第六天，10次實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)據(jù) 曲線如圖1所示。
[0026] 改良的查氏培養(yǎng)基，即在查氏培養(yǎng)基中添加0.2%酵母粉與1%玉米淀粉，pH 5. 8 ; 查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵 〇? 〇lg，鹿糖 30g，瓊脂 20g，蒸餾水 1L，121°C滅菌 15 min ; 由圖1可見(jiàn)，黑曲霉GB0506的發(fā)酵最高酶活為27500 U/mL，而黑曲霉CICHM F0410的 最高酶活為26100 U/mL。黑曲霉GB0506的發(fā)酵酶活稍高于黑曲霉CICHM F0410。但從發(fā) 酵酶活曲線看，黑曲霉CICHM F0410從第2天（48小時(shí)的時(shí)候）開(kāi)始酶活就以比較快的速 度持續(xù)增長(zhǎng)，并一直持續(xù)約3天時(shí)間，在第5天接近最高酶活，在生產(chǎn)任務(wù)緊張時(shí)也可以直 接放罐，馬上進(jìn)行下一輪發(fā)酵，因此生產(chǎn)安排具有很大的靈活性，在電力緊張時(shí)具有節(jié)約電 能的潛力。而黑曲霉GB0506在發(fā)酵的前4天酶活均遠(yuǎn)低于CICHM R)410,在第4天到第5 天之間存在一個(gè)特有的酶活快速線性增長(zhǎng)的階段，但這個(gè)酶活線性增長(zhǎng)的階段只能維持24 小時(shí)，在第五天就結(jié)束了。根據(jù)上述情況，如果在黑曲霉GB0506發(fā)酵的第5天，酶活快速線 性增長(zhǎng)階段即將結(jié)束時(shí)及時(shí)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基則有可能使這個(gè)酶活線性增長(zhǎng)的階段得到延 續(xù)從而提高糖化酶的產(chǎn)量。單個(gè)發(fā)酵罐的容量是有限的，如果將已有的發(fā)酵液分割成幾份， 分配到幾個(gè)發(fā)酵罐中，則可以補(bǔ)加大量發(fā)酵液，這有可能使這個(gè)黑曲霉GB0506發(fā)酵特有的 酶活快速線性增長(zhǎng)階段得到延伸。
[0027] 實(shí)施例2: 15L發(fā)酵罐發(fā)酵液分割時(shí)機(jī)的確定 為確定15 L發(fā)酵罐發(fā)酵液分割的最佳時(shí)機(jī)，分別在第3、4、5、6天的時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵液分 害J，將發(fā)酵液平均分割為3罐，再用發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至10 L。分別各進(jìn)行10次平行試 驗(yàn)，平均結(jié)果如表1所示。
[0028] 表1 一分三工藝發(fā)酵液分割時(shí)機(jī)對(duì)發(fā)酵進(jìn)程的影響
注：分割時(shí)機(jī)表不進(jìn)行發(fā)酵液分割的時(shí)間點(diǎn) 由表1可見(jiàn)，在酶活線性增長(zhǎng)階段或此階段之前進(jìn)行發(fā)酵液分割(也就是在發(fā)酵進(jìn)行 到第3-5天時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液分割)，則總發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)并不多，發(fā)酵液分割為3罐后單罐總 發(fā)酵時(shí)間比不分割的情況延長(zhǎng)約10-18小時(shí)。在酶活達(dá)到最高點(diǎn)后（即第六天時(shí)）進(jìn)行發(fā) 酵液分割則分割后需要進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵才能達(dá)到酶活最高點(diǎn)，這可能與這一時(shí)間點(diǎn)菌 體生長(zhǎng)停滯，代謝活力下降有關(guān)。從上述實(shí)