甲基化dna的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甲基化DNA的檢測(cè)方法。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及一種將用亞硫 酸氫鹽處理了的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其產(chǎn)物通過(guò)離子交換色譜進(jìn)行分析的迅速且簡(jiǎn)便的 甲基化DNA的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年，已認(rèn)識(shí)到表觀遺傳學(xué)參與各種生命現(xiàn)象，與其解析相關(guān)的研究正在積極進(jìn) 行。尤其是，已闡明DNA的異常甲基化深度參與癌癥化而受到關(guān)注。作為癌細(xì)胞中的特征 性的表觀遺傳異常，已知部分基因啟動(dòng)子區(qū)域中的CpG島的異常DNA甲基化。CpG島是介 由磷酸二酯鍵（P)的胞嘧啶（C)-鳥嘌呤（G)的2堿基序列高頻出現(xiàn)的區(qū)域，其多存在于 基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域。CpG島的異常DNA甲基化通過(guò)癌抑制基因的失活等來(lái)參與癌變。 CDKN2A、CDH1、MLH1、RB、BRCA1、TSLC1、RUNX3等各種癌抑制基因由于啟動(dòng)子區(qū)域存在的CpG 島的異常甲基化導(dǎo)致失活從而誘發(fā)癌化。DNA被甲基化時(shí)，由于該DNA甲基化在細(xì)胞分裂時(shí) 被復(fù)制，由子細(xì)胞繼承，因此癌抑制基因因異常甲基化而失活時(shí)，癌抑制基因失活的狀態(tài)會(huì) 持續(xù)。
[0003] 作為已經(jīng)確立的甲基化DNA的解析方法，有利用亞硫酸氫鹽（重亞硫酸鹽、 bisulfite)反應(yīng)的方法。該方法是甲基化DNA解析中最通用的方法。用亞硫酸氫鹽處理單 鏈DNA時(shí)，胞嘧啶經(jīng)過(guò)磺化、水解脫氨化、脫磺化，被變換為尿嘧啶。另一方面，被甲基化的 胞嘧啶，由于最初發(fā)生的磺化的反應(yīng)速度極慢，因此在實(shí)際進(jìn)行的亞硫酸氫鹽處理的反應(yīng) 時(shí)間中仍保持為甲基化胞啼啶。因此，使用亞硫酸氫鹽處理了的DNA進(jìn)行PCR (Polymerase Chain Reaction)時(shí)，甲基化胞嘧啶仍為胞嘧啶，但是非甲基化胞嘧啶由尿嘧啶被置換為 胸腺嘧啶而被擴(kuò)增。利用該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列中產(chǎn)生的胞嘧啶和胸腺嘧啶的堿基差 異，解析甲基化狀態(tài)。將其作為基本原理而通用的方法是專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)1記載 的 Methylation-Specific PCR(MSP)法和非專利文獻(xiàn) 2、3 記載的 Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA)法。
[0004] MSP法是在DNA的亞硫酸氫鹽處理后，依次進(jìn)行使用了甲基化序列特異引物和非 甲基化序列特異引物的PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)兩個(gè)引物所致的擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú) 來(lái)判定對(duì)象區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)的方法。COBRA法是在DNA的亞硫酸氫鹽處理后，依次進(jìn) 行使用甲基化DNA和非甲基化DNA共同的引物的PCR擴(kuò)增、使用識(shí)別甲基化DNA和非甲基化 DNA中序列不同的位置的限制性內(nèi)切酶的處理、瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)限制性內(nèi)切酶處理片 段的有無(wú)來(lái)判定對(duì)象區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)的方法。兩種方法從在沒有特別的裝置的情況 下能夠進(jìn)行甲基化DNA的定量解析的方面來(lái)看均是目前廣泛使用的方法，但是存在在解析 中使用電泳法這點(diǎn)上需要花費(fèi)勞動(dòng)和時(shí)間的課題。
[0005] 另一方面，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的核酸、蛋白質(zhì)、多糖類等生物高分子的分 離分析中，作為簡(jiǎn)便且短時(shí)間能夠精度良好地檢測(cè)的方法，通用的是離子交換色譜。離子交 換色譜是利用柱填充劑的離子交換基團(tuán)和測(cè)定對(duì)象物質(zhì)中的離子性基團(tuán)之間發(fā)生的靜電 相互作用而分離測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的方法，包括利用陰離子交換的離子交換色譜和利用陽(yáng)離子 交換的離子交換色譜。陰離子交換色譜使用具有陽(yáng)離子性官能團(tuán)作為離子交換基團(tuán)的柱填 充劑，能夠分離陰離子性物質(zhì)。此外，陽(yáng)離子交換色譜使用具有陰離子性官能團(tuán)作為離子交 換基團(tuán)的柱填充劑，能夠分離陽(yáng)離子性物質(zhì)。
[0006] 使用離子交換色譜分離核酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，通常使用利用核酸分子中含有的 磷酸的負(fù)電荷進(jìn)行分離的陰離子交換色譜。作為陰離子交換色譜中的柱填充劑的陽(yáng)離子性 官能團(tuán)，包括二乙基氨基乙基這樣的弱陽(yáng)離子性基團(tuán)、季銨基這樣的強(qiáng)陽(yáng)離子性基團(tuán)。填充 有含有這些陽(yáng)離子性的官能團(tuán)作為離子交換基團(tuán)的柱填充劑的色譜柱已經(jīng)市售，在多個(gè)研 究領(lǐng)域中使用。
[0007] 此外本發(fā)明人報(bào)告了作為離子交換色譜用柱填充劑，開發(fā)了含有強(qiáng)陽(yáng)離子性基團(tuán) 和弱陽(yáng)離子性基團(tuán)這兩種基團(tuán)作為柱填充劑的陽(yáng)離子性官能團(tuán)的柱填充劑，通過(guò)使用了填 充有該填充劑的柱的離子交換色譜，分離分析了 20mer的非甲基化合成寡聚核苷酸間的單 堿基的差異（專利文獻(xiàn)2)。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)1:美國(guó)專利第5786146號(hào)公報(bào)
[0011] 專利文獻(xiàn)2:國(guó)際公開公報(bào)第2012/108516號(hào)小冊(cè)子
[0012] 非專利文獻(xiàn)
[0013] 非專利文獻(xiàn) l:Proc. Natl. Acad. Sci.USA，93,9821-9826 (1996)
[0014] 非專利文獻(xiàn) 2:Nucleic Acids Res.，24, 5058-5059 (1996)
[0015] 非專利文獻(xiàn) 3:Nucleic Acids Res.，25,2532-2534(1997)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 如上所述，基于利用了亞硫酸氫鹽反應(yīng)的DNA甲基化解析進(jìn)行癌風(fēng)險(xiǎn)診斷時(shí)，為 了更早期或更正確的診斷，要求精度良好地檢測(cè)由亞硫酸氫鹽反應(yīng)產(chǎn)生的DNA堿基序列的 差異。本發(fā)明的課題在于提供一種消除利用電泳的解析所需要的勞動(dòng)和時(shí)間的、迅速且簡(jiǎn) 便的甲基化DNA的檢測(cè)方法。特別是，本發(fā)明的課題在于提供一種檢測(cè)信號(hào)的分離性能良 好，能夠以高精度且高靈敏度檢測(cè)DNA甲基化的方法。
[0017] 本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)將用亞硫酸氫鹽處理的DNA通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物通過(guò)離子交換色譜進(jìn)行分離，從而能夠迅速且簡(jiǎn)便地檢測(cè)甲基化DNA。本發(fā)明人等然 后進(jìn)一步對(duì)離子交換色譜的分析條件進(jìn)行深入研究，最終令人驚訝地發(fā)現(xiàn)甲基化DNA的檢 測(cè)信號(hào)的峰分離依賴于該離子交換色譜的柱溫度而飛躍式提高，進(jìn)而完成本發(fā)明。
[0018] 本發(fā)明具有以下構(gòu)成。
[0019] [1] 一種甲基化DNA的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括以下工序（1)、⑵和⑶：
[0020] (1)用亞硫酸氫鹽處理樣品DNA的工序；
[0021] (2)將該用亞硫酸氫鹽處理了的樣品DNA通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增的工序；以及
[0022] (3)將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交換色譜的工序。
[0023] [2] -種甲基化DNA的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括以下工序（1)、⑵和（3'）：
[0024] (1)用亞硫酸氫鹽處理樣品DNA的工序；
[0025] (2)將該用亞硫酸氫鹽處理了的樣品DNA通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增的工序；以及
[0026] (3'）在45°C以上且小于90°C的柱溫度下，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交 換色譜的工序。
[0027] [3]根據(jù)[1]或[2]記載的方法，其中，上述離子交換色譜是陰離子交換色譜。
[0028] [4]根據(jù)[1]~[3]中任1項(xiàng)記載的方法，其中，上述離子交換色譜中使用的柱填 充劑含有在表面具有強(qiáng)陽(yáng)尚子性基團(tuán)和弱陽(yáng)尚子性基團(tuán)這兩種基團(tuán)的基材粒子。
[0029] [5]根據(jù)[1]~[4]中任1項(xiàng)記載的方法，其中，上述離子交換色譜中，上述PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物的洗脫所使用的洗脫液含有反離液離子。
[0030] [6]根據(jù)[1]~[5]中任1項(xiàng)記載的方法，其中，上述反離液離子是硫酸根離子和 銨根離子中的任一種或兩種。
[0031] [7]根據(jù)[1]~[6]中任1項(xiàng)記載的方法，其中，進(jìn)一步包括以下工序：將用亞硫 酸氫鹽處理上述樣品DNA而得的產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交換色譜得到的檢測(cè)信號(hào)， 與用亞硫酸氫鹽處理與上述樣品DNA的堿基序列相同但沒有甲基化的DNA而得的產(chǎn)物的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、或用亞硫酸氫鹽處理與上述樣品DNA的堿基序列相同且甲基化的比例已知 的DNA而得的產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交換色譜得到的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行比較。
[0032] [8]根據(jù)[7]記載的方法，其中，進(jìn)一步包括以下工序：基于上述比較的工序的結(jié) 果，測(cè)定上述樣品DNA中的甲基化DNA有無(wú)存在、甲基化率或存在比率。
[0033] [9]根據(jù)[1]~[6]中任1項(xiàng)記載的方法，其中，進(jìn)一步包括以下工序：從用亞硫酸 氫鹽處理上述樣品DNA而得的產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交換色譜得到的檢測(cè)信號(hào)中， 減去用亞硫酸氫鹽處理與上述樣品DNA的堿基序列相同但沒有甲基化的DNA而得的產(chǎn)物的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交換色譜得到的檢測(cè)信號(hào)，得到差值數(shù)據(jù)。
[0034] [10]根據(jù)[9]記載的方法，其中，進(jìn)一步包括以下工序：基于上述差值數(shù)據(jù)，測(cè)定 上述樣品DNA中的甲基化DNA有無(wú)存在、甲基化率或存在比率。
[0035] [11] 一種從樣品DNA的信號(hào)提取甲基化DNA的信號(hào)的方法，包括以下工序⑴~ (6)：
[0036] (1)用亞硫酸氫鹽處理樣品DNA的工序；
[0037] (2)將該用亞硫酸氫鹽處理了的樣品DNA通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增的工序；
[0038] (3)將工序（2)中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交換色譜的工序；
[0039] (4)用亞硫酸氫鹽處理與該樣品DNA的堿基序列相同但沒有甲基化的DNA并進(jìn)行 PCR擴(kuò)增的工序；
[0040] (5)將工序（4)中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交換色譜的工序；以及
[0041] (6)從工序（3)中得到的色譜檢測(cè)信號(hào)中減去工序（5)中得到的色譜檢測(cè)信號(hào)而 得到差值數(shù)據(jù)的工序。
[0042] [12]離子交換色譜用柱在甲基化DNA檢測(cè)中的使用，其中，所述離子交換色譜用 柱填充有柱填充劑，所述柱填充劑含有在表面具有強(qiáng)陽(yáng)離子性基團(tuán)和弱陽(yáng)離子性基團(tuán)這兩 種基團(tuán)的基材粒子。
[0043] [13]離子交換色譜用洗脫液在甲基化DNA檢測(cè)中的使用，其中，所述離子交換色 譜用洗脫液含有反離液離子。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明，提供一種利用離子交換色譜的甲基化DNA的檢測(cè)方法。本發(fā)明的方 法中進(jìn)行的離子交換色譜，甲基化DNA和非甲基化DNA的檢測(cè)信號(hào)的峰分離優(yōu)異，能夠精度 良好地檢測(cè)甲基化DNA。因此，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種不需要電泳法這樣的勞動(dòng)和時(shí)間 的、迅速且簡(jiǎn)便且高精度的甲基化DNA的檢測(cè)方法。本發(fā)明的甲基化DNA的檢測(cè)方法對(duì)癌 風(fēng)險(xiǎn)檢查等臨床檢查是有用的。
【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1是使用了參考例1中得到的陰離子交換柱的、來(lái)自CDKN2A基因啟動(dòng)子的甲基 化DNA和非甲基化DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（136bp)的色譜圖。