經(jīng)由與碳儲(chǔ)存有關(guān)的CoA依賴性碳鏈延長(zhǎng)生成6碳化學(xué)品的方法
【專利說(shuō)明】經(jīng)由與碳儲(chǔ)存有關(guān)的CoA依賴性碳鏈延長(zhǎng)生成6碳化學(xué)品 的方法
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)是2011年12月14日提交的美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)13/715,981的部分連續(xù)案， 其要求2011年12月16日提交的美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)61/576, 401的優(yōu)先權(quán)。通過(guò)提及完整并 入申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及使用一種或多種分離的酶（諸如0 _酮硫解酶、脫氫酶、還原酶、硫酯 酶、水合酶、單加氧酶、和轉(zhuǎn)氨酶）或使用表達(dá)一種或多種此類酶的重組宿主細(xì)胞生物合成 己二酸（adipicacid)、6-氨基己酸、6-羥基己酸、己亞甲基二胺、己內(nèi)酰胺、和1，6-己二醇 中一種或多種的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 尼龍是聚酰胺，其通常通過(guò)二胺與二羧酸的縮聚合成。類似地，尼龍可通過(guò)內(nèi)酰胺 的縮聚生成。一種無(wú)處不在的尼龍是尼龍6, 6,其通過(guò)六亞甲基二胺（HMD)和己二酸的反應(yīng) 生成。尼龍6可以通過(guò)己內(nèi)酰胺的開(kāi)環(huán)聚合生成。因此，己二酸、己亞甲基二胺和己內(nèi)酰胺 是尼龍生產(chǎn)中的重要中間體（Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymer ScienceandTechnology, 2001)〇
[0006] 在產(chǎn)業(yè)上，經(jīng)由環(huán)己胺的空氣氧化生產(chǎn)己二酸和己內(nèi)酰胺。環(huán)己胺的空氣氧 化在一系列的步驟中生成環(huán)己酮（K)和環(huán)己醇㈧的混合物，稱為KA油。KA油的硝 酉愛(ài)氧化生成己二酉愛(ài)(Musser,Adipicacid,Ullmann'sEncyclopediaofIndustrial Chemistry, 2000)。己內(nèi)酰胺從環(huán)己酮經(jīng)由其聘和隨后的酸重排生成（Fuchs,Kieczkaand Moran,Caprolactam,Ullmann,sEncyclopediaofIndustrialChemistry, 2000)〇
[0007] 在產(chǎn)業(yè)上，通過(guò)將C6結(jié)構(gòu)單元?dú)淝杌杉憾?，接著氫化成HMD(HerzogandSmi ley,Hexamethylenediamine,Ullmann,sEncyclopediaofIndustrialChemistry, 2012) 生產(chǎn)己亞甲基二胺（HMD)。
[0008] 鑒于對(duì)石油化學(xué)給料的依賴性；生物技術(shù)提供了一種經(jīng)由生物催化的備選方法。 生物催化是使用生物催化劑（諸如酶）來(lái)實(shí)施有機(jī)化合物的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。
[0009] 生物衍生給料和石油化學(xué)給料兩者是用于生物催化過(guò)程的可行起始材料。
[0010] 因而，針對(duì)此背景，清楚的是需要用于生成己二酸、己內(nèi)酰胺、6-氨基己酸、6-羥 基己酸、己亞甲基二胺、和1，6-己二醇（下文為"C6結(jié)構(gòu)單元"）中一種或多種的可 持續(xù)方法，其中所述方法是基于生物催化劑的（Jang等，Biotechnology&Bioengineeri ng，2012, 109(10)，2437 - 2459)。
[0011] 然而，無(wú)野生型原核生物或真核生物天然過(guò)度生成C6結(jié)構(gòu)單元或?qū)⑵?排出至胞外環(huán)境。不過(guò)，已經(jīng)報(bào)告了己二酸和己內(nèi)酰胺的代謝（Ramsay等，Appl. Environ.Microbiol. , 1986, 52(1), 152 - 156 ；及KulkarniandKanekar,Current Microbiology, 1998, 37, 191 - 194)。
[0012] 二羧酸己二酸作為碳源經(jīng)由氧化被眾多細(xì)菌和真菌有效轉(zhuǎn)化成中心代謝物。 輔酶A(C〇A)活化的己二酸到CoA活化的3-氧代己二酸的氧化經(jīng)由例如與芳香族底物 降解有關(guān)的途徑促進(jìn)進(jìn)一步代謝。已經(jīng)廣泛表征了 3-氧代己二?；?CoA被幾種細(xì)菌和 真菌分解代謝成乙?；?CoA和琥泊酰基-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewof Microbiology, 1996, 50:553 - 590)。己二酸和6-氨基己酸兩者都是己內(nèi)酰胺的分解代謝 中的中間體，其最終經(jīng)由3-氧代己二酰基被降解成中心代謝物。
[0013] 已經(jīng)提示了用于從生物量-糖生成己二酸的潛在代謝途徑：（1)經(jīng)由鄰位切割芳 香族降解途徑從葡萄糖以生物化學(xué)方式得到順，順 -粘康酸（cis，cis-muconicacid)，接 著化學(xué)催化成己二酸；（2)經(jīng)由琥珀?；?CoA和乙?；?CoA的縮合的可逆己二酸降解途 徑和（3)組合0 _氧化、脂肪酸合酶和氧化。然而，尚未報(bào)告使用這些策略的信息（Jang 等，Biotechnology&Bioengineering，2012, 109 (10)，2437 - 2459) 〇
[0014] 最優(yōu)性原理陳述微生物調(diào)節(jié)其生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)以支持最大生物量生長(zhǎng)。超出宿主 生物體中表達(dá)異源路徑的需要，將碳流量引向充當(dāng)碳源而非充當(dāng)生物量生長(zhǎng)成分的C6結(jié) 構(gòu)單元與最優(yōu)性原理矛盾。例如，與天然生產(chǎn)者的產(chǎn)量性能相比，將1-丁醇途徑從梭菌 (Clostridium)物種轉(zhuǎn)移入其它生產(chǎn)菌株中經(jīng)常下降一個(gè)數(shù)量級(jí)（Shen等，Appl.Environ. Microbiol. , 2011, 77(9), 2905 - 2915) 〇
[0015] 在C6脂肪族主鏈上形成末端官能團(tuán)（諸如羧基、胺或羥基基團(tuán)）前，6碳脂肪族主 鏈前體的有效合成是合成C6結(jié)構(gòu)單元中的重要考慮因素。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 本文件至少部分基于如下的發(fā)現(xiàn)：有可能構(gòu)建生成6碳鏈脂肪族主鏈前體的生物 化學(xué)路徑，其中可以形成兩個(gè)官能團(tuán)（例如羧基、胺或羥基），從而導(dǎo)致己二酸、6-氨基己 酸、6-羥基己酸、己亞甲基二胺、己內(nèi)酰胺、和1，6-己二醇（下文為"C6結(jié)構(gòu)單元"）中一種 或多種的合成。己二酸和己二酸鹽、6-羥基己酸和6-羥基己酸鹽及6-氨基己酸和6-氨基 己酸鹽在本文中可互換使用，指其任何中性或離子化形式的化合物，包括其任何鹽形式。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，具體的形式會(huì)取決于pH。本文中描述的這些途徑、代謝工程和培養(yǎng) 策略取決于與聚羥基烷酸酯積累細(xì)菌的碳儲(chǔ)存途徑相關(guān)的其CoA依賴性延長(zhǎng)酶或者同源 物。
[0018] 面對(duì)最優(yōu)性原理，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了可以組合合適的非天然途徑、給料、宿主微生 物、對(duì)宿主生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)的弱化策略和培養(yǎng)策略來(lái)有效生成C6結(jié)構(gòu)單元。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，可以使用NADH或NADPH依賴性酶經(jīng)由兩個(gè)循環(huán)的CoA依賴性 碳鏈延長(zhǎng)從乙酰基-CoA形成用于轉(zhuǎn)化成C6結(jié)構(gòu)單元的C6脂肪族主鏈。參見(jiàn)圖1和圖2。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，生成C6脂肪族主鏈的CoA依賴性碳鏈延長(zhǎng)途徑中的酶催化不 可逆酶促步驟。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，可以使用硫酯酶、醛脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、7-氧代庚酸 脫氫酶、或單加氧酶（例如與氧化還原酶和鐵氧還蛋白組合）酶促形成末端羧基基團(tuán)。參見(jiàn) 圖3和圖4。硫酯酶可以與SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，可以使用轉(zhuǎn)氨酶或脫乙酰酶酶促形成末端胺基團(tuán)。參見(jiàn) 圖5和圖6。轉(zhuǎn)氨酶可以與SEQIDN0:7-12中所列的任一種氨基酸序列具有至少70% 序列同一性。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，可以使用單加氧酶（例如與氧化還原酶和鐵氧還蛋白組合） 或醇脫氫酶酶促形成末端羥基基團(tuán)。參見(jiàn)圖7和圖8。單加氧酶可以與SEQIDN0:13-15 中所列的任一種氨基酸序列具有至少70%序列同一性。
[0024] 在一個(gè)方面，本文件特征在于一種用于生物合成一種或多種選自己二酸、6-氨基 己酸、6-羥基己酸、己亞甲基二胺、己內(nèi)酰胺、和1，6-己二醇的產(chǎn)物的方法。所述方法包括 酶促合成6碳鏈脂肪族主鏈（例如己酰基-CoA)，并且在一個(gè)或多個(gè)步驟中在所述主鏈中酶 促形成兩個(gè)選自羧基、胺、和羥基基團(tuán)的末端官能團(tuán)以直接生成所述產(chǎn)物或在隨后的步驟 中生成所述產(chǎn)物。兩個(gè)末端功能團(tuán)可以是相同的（例如羥基或胺）或者可以是不同的（例 如末端羥基基團(tuán)和末端羧基基團(tuán)；或末端胺和末端羧基基團(tuán)）。
[0025] 己酰基-CoA可以使用NADH或NADPH依賴性酶經(jīng)由兩個(gè)循環(huán)的CoA依賴性碳鏈延 長(zhǎng)從乙?；?CoA酶促合成?？梢酝ㄟ^(guò)在EC1.3. 1.44、EC1.3. 1.38、或EC1.3. 1.8下分 類的稀?；?CoA還原酶，諸如ter或tdter的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化己-2-稀?；?CoA形成己酰 基-CoA?？梢酝ㄟ^(guò)EC4. 2. 1. 17下分類的反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（S) 3-羥基己 ?；?CoA或者通過(guò)EC4. 2. 1. 119下分類的反式-2-烯酰基-CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基 己?；?CoA形成己-2-烯?；?CoA。反式-2-烯?；?CoA水合酶可以是crt的基因產(chǎn) 物。可以通過(guò)EC1.1. 1.35下分類的3-羥基?；?CoA脫氫酶，諸如由fadB編碼的3-羥 基?；?CoA脫氫酶轉(zhuǎn)化3-氧代己?；?CoA形成（S) 3-羥基己酰基-CoA?？梢酝ㄟ^(guò)EC 2. 3. 1. 16下分類的0 -酮硫解酶（諸如由bktB編碼的）轉(zhuǎn)化丁?；?CoA形成3-氧代己 ?；?CoA?？梢酝ㄟ^(guò)EC1. 3. 1. 44、EC1. 3. 1. 38、或EC1. 3. 1. 8下分類的烯?；?CoA還 原酶轉(zhuǎn)化巴豆酰基-CoA形成丁?；?CoA?？梢酝ㄟ^(guò)EC4. 2. 1. 17下分類的反式-2-烯酰 基-CoA水合酶轉(zhuǎn)化（S) 3-羥基丁?；?CoA形成巴豆?；?CoA。可以通過(guò)EC1. 1. 1. 157 下分類的3-羥基丁?；?CoA脫氫酶，諸如由hbd編碼的3-羥基丁?；?CoA脫氫酶轉(zhuǎn)化 乙酰乙?；?CoA形成（S) 3-羥基丁酰基-CoA?？梢酝ㄟ^(guò)EC2. 3. 1. 9下分類的0 -酮硫 解酶（諸如由atoB或phaA編碼的）轉(zhuǎn)化乙?；?CoA形成乙酰乙?；?CoA?？梢酝ㄟ^(guò)EC 2. 3. 1. 194下分類的乙酰乙酰基-CoA合酶轉(zhuǎn)化丙二?；?CoA形成乙酰乙?；?CoA?？梢?通過(guò)EC6. 4. 1. 2下分類的乙?；?CoA羧化酶轉(zhuǎn)化乙?；?CoA形成丙二?；?CoA。
[0026] 可以通過(guò)EC1. 1. 1. 100下分類的3-氧代酰基-CoA還原酶（諸如由fabG編碼的） 轉(zhuǎn)化3-氧代己酰基-CoA形成（R) 3-羥基己?；?CoA?？梢酝ㄟ^(guò)EC4. 2. 1. 119下分類的 反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基丁?；?CoA形成巴豆?；?CoA。反式-2-烯 酰基-CoA水合酶可以是phaj的基因產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^(guò)EC1. 1. 1. 36下分類的乙酰酰基-CoA 還原酶（諸如由phaB編碼的）轉(zhuǎn)化乙酰乙?；?CoA形成（R) 3-羥基丁?；?CoA。
[0027] 在本文中描述的任何方法中，方法可以包括通過(guò)使用硫酯酶和醛脫氫酶，或硫酯 酶在己酰基CoA中形成第一個(gè)末端羧基基團(tuán)生成己酸。硫酯酶可以由YciA、tesB或Acotl3 編碼。硫酯酶可以與SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。
[0028] 可以通過(guò)EC1. 2. 1. 4下分類的醛脫氫酶在己醛中形成第一個(gè)末端羧基基團(tuán)生成 己酸?？梢酝ㄟ^(guò)EC1. 2. 1. 57下分類的正丁醛脫氫酶轉(zhuǎn)化己?；?CoA形成己醛。
[0029] 羧酸還原酶（例如與磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶組合）可以在形成所述產(chǎn)物中形 成末端醛基團(tuán)作為中間體。羧酸還原酶可以與SEQIDN0. 2-6中所列的任一種氨基酸序列 具有至少70 %序列同一性。
[0030] 在本文中描述的任何方法中，方法可以包括用一種或多種酶促轉(zhuǎn)化將己酸轉(zhuǎn)化己 二酸、6-氨基己酸、己亞甲基二胺、6-羥基己酸、e己內(nèi)酰胺或1，6己二醇，其中酶促轉(zhuǎn)化 之一引入第二個(gè)末端官能團(tuán)。方法可以包括使用諸如來(lái)自家族CYP153的單加氧酶（諸如 CYP153A)將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸。可以使用（i)醇脫氫酶（諸如由YMR318C編碼）、5_羥 基戊酸脫氫酶（諸如由cpnD編碼）或4-羥基丁酸脫氫酶（諸如由gabD編碼）（ii)6-羥 基己酸脫氫酶（諸如由ChnD編碼），或（iii)細(xì)胞色素P450家族中的單加氧酶將6-羥基 己酸轉(zhuǎn)化成己二酸半醛。
[0031] 在本文中描述的任何方法中，可以通過(guò)使用（i)EC1. 2. 1. 3下分類的醛脫氫酶， (ii)EC1.2. 1.63下分類的6-氧代己酸脫氫酶（諸如由ChnE編碼）或EC1.2. 1.-下分類 的7-氧代庚酸脫氫酶（例如ThnG的基因產(chǎn)物）或iii)細(xì)胞色素P450家族中的單加氧酶 在己二酸半醛中形成第二個(gè)末端官能團(tuán)生成己二酸。
[0032] 在本文中描述的任何方法中，可以通過(guò)使用EC2. 61. 18、EC2.6. 1. 19、EC 2. 6. 1.29、EC2. 6. 1.48、或EC2. 6. 1.82下分類的轉(zhuǎn)氨酶在己二酸半醛中形成第二個(gè) 末端官能團(tuán)生成6-氨基己酸。
[0033] 在本文中描述的任何方法中，可以通過(guò)使用EC3. 5. 2.-下分類的內(nèi)酰胺酶自 6-氨基己酸生成己內(nèi)酰胺。自6-氨基己酸的末端羧基基團(tuán)和末端胺基團(tuán)生成與己內(nèi)酰胺 有關(guān)的酰胺鍵。
[0034] 在本文中描述的任何方法中，可以通過(guò)使用EC2. 61. 18、EC2.6. 1. 19、EC 2. 6. 1. 29、EC2. 6. 1. 48或EC2. 6. 1. 82下分類的轉(zhuǎn)氨酶在（i) 6-氨基己醛中或者使用例 如在EC3.5. 1. 17下分類的脫乙酰酶在（ii)N6-乙?；?1，6-二氨基己烷中形成第二個(gè)末 端官能團(tuán)生成己亞甲基二胺。
[0035] 在本文中描述的任何方法中，可以通過(guò)使用EC1. 1. 1.-(例如1、2、21、或184)下 分類的醇脫氫酶（諸如由YMR318C、YqhD或CAA81612. 1編碼）在6-羥基己醛中形成第二 個(gè)末端官能團(tuán)生成1，6己二醇。
[0036] 在一些實(shí)施方案中，對(duì)發(fā)酵補(bǔ)料的主要碳源可以是或者可以源自生物或非生物給 料。在一些實(shí)施方案中，所述生物給料是，包括或者源自單糖、二糖、木質(zhì)纖維素、半纖維素、 纖維素、木質(zhì)素、乙酰丙酸（levulinicacid)、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物、濃 縮酒糟（condenseddistillers'solubles)或城市廢物。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，非生物給料可以是或者可以源自天然氣、合成氣、C02/H2、甲 醇、乙醇、來(lái)自環(huán)己烷氧化過(guò)程的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或堿洗廢物流、或?qū)Ρ蕉姿?異 酞酸混合物廢物流。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，宿主微生物是原核生物。例如，原核生物可以來(lái)自細(xì)菌埃希 氏菌屬如大腸桿菌；細(xì)菌梭菌屬如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌或者克魯佛梭菌；細(xì)菌棒狀桿 菌屬如谷氨酸棒狀桿菌；細(xì)菌貪銅菌屬如鉤蟲(chóng)貪銅菌或者耐金屬貪銅菌；細(xì)菌假單胞菌屬 如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌或者食油假單胞菌；細(xì)菌代爾夫特菌屬如食酸代爾夫特菌； 細(xì)菌芽孢桿菌屬如枯草芽胞桿菌；細(xì)菌乳桿菌屬如德氏乳桿菌；或者細(xì)菌乳球菌屬如乳酸 乳球菌。此類原核生物也可以是構(gòu)建能夠生成C6結(jié)構(gòu)單元的本文中描述的重組宿主細(xì)胞 的基因來(lái)源。
[0039] 在一些實(shí)施方案中，宿主微生物是真核生物（例如真菌，諸如酵母）。例如，真核 生物可以來(lái)自真菌曲霉屬如黑曲霉；來(lái)自酵母酵母屬如釀酒酵母；來(lái)自酵母畢赤氏酵屬如 巴斯德畢赤酵母；來(lái)自酵母耶羅維亞酵母屬如解脂耶羅維亞酵母；來(lái)自酵母伊薩酵母屬如 東方伊薩酵母；來(lái)自酵母德巴利酵母屬如漢遜德巴利酵母；來(lái)自酵母Arxula屬如Arxula adenoinivorans;或者來(lái)自酵母克魯維酵母菌屬如乳酸克魯維酵母菌的。此類真核生物也 可以是構(gòu)建能夠生成C6結(jié)構(gòu)單元的本文中描述的重組宿主細(xì)胞的基因來(lái)源。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，宿主微生物的對(duì)高濃度的一種或多種C6結(jié)構(gòu)單元的耐受性 可以通過(guò)在選擇性環(huán)境中的連續(xù)培養(yǎng)來(lái)改善。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，弱化或增強(qiáng)宿主微生物的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)以（1)確保乙酰 基-CoA的胞內(nèi)利用度，（2)產(chǎn)生NADH或NADPH不平衡，其僅可以經(jīng)由一種或多種C6結(jié)構(gòu)單 元的形成來(lái)平衡，（3)阻止降解導(dǎo)致并包含C7結(jié)構(gòu)單元的中心代謝物，中心前體，并且（4) 確保從細(xì)胞的有效流出。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，使用非循環(huán)培養(yǎng)策略來(lái)實(shí)現(xiàn)厭氧、需氧或微需氧培養(yǎng)條件。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，使用循環(huán)培養(yǎng)策略來(lái)在厭氧和需氧培養(yǎng)條件之間交替。
[0044] 在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)策略包括限制營(yíng)養(yǎng)物，諸如限制氮、磷酸鹽或氧。
[0045] 在一些實(shí)施方案中，使用非循環(huán)或循環(huán)發(fā)酵策略通過(guò)單一類型的微生物（例如含 有一種或多種外源核酸的重組宿主）生成一種或多種C6結(jié)構(gòu)單元。
[0046] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)共培養(yǎng)超過(guò)一種類型的微生物（例如兩種或更多種不同 重組宿主）生成一種或多種C6結(jié)構(gòu)單元，其中每種宿主含有特定組的外源核酸。
[0047] 在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)連續(xù)發(fā)酵生成一種或多種C6結(jié)構(gòu)單元，其中可以將 來(lái)自前面發(fā)酵的培養(yǎng)液或濃縮物（centrate)補(bǔ)料給一連串發(fā)酵，作為給料、中心代謝物或 中心前體的來(lái)源；最終生成C6結(jié)構(gòu)單元。
[0048] 本文件特征還在于包含至少一種編碼例如下列一種或多種的外源核酸的重組宿 主：甲酸脫氫酶、烯?；?CoA還原酶、反式-2-烯酰基-CoA水合酶、3-羥基丁?；?CoA脫 氫酶、0 -酮硫解酶、乙酰?；?CoA還原酶、乙?；?CoA合成酶、乙?；?CoA羧化酶、蘋 果酸酶、吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶、甘油醛-3P-脫氫酶、硫酯酶、醛脫氫酶、單加氧酶、醇脫氫酶、 6-羥基己酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶、4-羥基丁酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、7-氧代庚 酸脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、丙?；?CoA合成酶、和羧酸還原酶，其中所述宿主包含一種或多種 例如在葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、乙酸激酶、將丙酮酸降解成乳酸的酶（諸如乳酸脫氫酶）、介 導(dǎo)磷酸烯醇丙酮酸降解成琥珀酸的酶（諸如menaquinol-延胡索酸氧化還原酶、醇脫氫酶、 丙酮酸脫羧酶、2-酮酸脫羧酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、或NADH特異性谷氨酸脫氫酶中的缺陷。
[0049] 在一個(gè)方面，本文件特征在于重組宿主，其包含至少一種編碼以下的外源核酸： (i) 0 _酮硫解酶或乙酰基-CoA羧化酶和乙酰乙?；?CoA合酶，（ii) 3-羥?；?CoA脫氫 酶或3-氧化酰基-CoA還原酶，（iii)稀酰基-CoA水合酶，和（iv)反式-2-稀?；?CoA還 原酶，其中所述宿主生成己?；?CoA。宿主進(jìn)一步可以包含硫酯酶、醛脫氫酶、或正丁醛脫 氫酶中的一種或多種，其中宿主生成己醛或己酸。
[0050] 生成己醛或己酸的重組體可以進(jìn)一步包含單加氧酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、6-羥基 己酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶、4-羥基丁酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、或7-氧代庚酸脫 氫酶中的一種或多種，其中宿主生成己二酸或己二酸半醛。
[0051] 生成己醛或己酸的重組體可以進(jìn)一步包含單加氧酶、轉(zhuǎn)氨酶、6-羥基己酸脫氫酶、 5-羥基戊酸脫氫酶、4-羥基丁酸脫氫酶、和醇脫氫酶中的一種或多種，其中宿主生成7-氨 基己酸。宿主可以進(jìn)一步包含內(nèi)酰胺酶并且生成己內(nèi)酰胺。
[0052] 生成己醛或己酸的重組體可以進(jìn)一步包含單加氧酶，所示宿主生成6-羥基己酸。
[0053] 生成己醛、己酸、6-羥基己酸、或6-氨基己酸的重組宿主可以進(jìn)一步包含羧酸還 原酶、轉(zhuǎn)氨酶、脫乙酰酶、N-乙?；D(zhuǎn)移酶、或醇脫氫酶中的一種或多種，并且生成己亞 甲基二胺。
[0054] 生成6-羥基己酸的重組宿主可以進(jìn)一步包含羧酸還原酶或醇脫氫酶，所示宿主 生成1，6_己二醇。
[0055] 本文中描述的任何重組宿主可以進(jìn)一步包含下列一種或多種弱化的酶：聚羥 基烷酸酯合酶、乙酰基-CoA硫酯酶、形成乙酸的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脫氫酶、 menaquinol-延胡索酸氧化還原酶、形成異丁醇的2-酮酸脫羧酶、形成乙醇的醇脫氫酶、磷 酸丙糖異構(gòu)酶、丙酮酸脫羧酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、NADH-消耗性轉(zhuǎn)氫酶、NADH-特異性 谷氨酸脫氫酶、NADH/NADPH利用性谷氨酸脫氫酶、庚二?；?CoA脫氫酶；接受C6結(jié)構(gòu)單元 和中心前體作為底物的?；?CoA脫氫酶；丁二酰基-CoA脫氫酶；或己二?；?CoA合成酶。
[0056] 本文中描述的任何重組宿主可以進(jìn)一步過(guò)表達(dá)一種或多種編碼以下的基因：乙酰 基-CoA合成酶；6-磷酸葡糖酸脫氫酶；轉(zhuǎn)酮醇酶；吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶；甘油醛-3P-脫氫酶； 蘋果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；葡萄糖脫氫酶；果糖1，6二磷酸酶；L-丙氨酸脫氫酶； L-谷氨酸脫氫酶；L-谷氨酰胺合成酶；甲酸脫氫酶；二胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；和/ 或多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0057]除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員的通常理解具有相同的意義。雖然可以使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的 方法和材料來(lái)實(shí)施本發(fā)明，但是下文描述了合適的方法和材料。通過(guò)提及完整并入本文中 提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、和其它出版物。在沖突的情況中，應(yīng)以本說(shuō)明書（包括 定義）為準(zhǔn)。另外，材料、方法和例子僅是例示性的，而不意圖為限制性的。
[0058] 本發(fā)明的一個(gè)或者多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在附圖和下面的描述中闡明。根據(jù)說(shuō)明書 和附圖，并根據(jù)權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見(jiàn)。根據(jù)專利法的標(biāo) 準(zhǔn)實(shí)踐，詞語(yǔ)"包含"在權(quán)利要求書中