））的一個以上進行組合，作為甲基化 DNA檢測中使用的試劑盒進行提供。上述本發(fā)明的試劑盒，在提供給公眾時、或向公眾發(fā)出 提供的告知時，通過表示或者提倡可以用于甲基化DNA的檢測的宗旨，或記載于記載有可 用于甲基化DNA的檢測的宗旨的文件、電子媒體（例如，使用說明書、目錄、小冊子、CD、Web 等），可以與其他柱、洗脫液識別開，這與本發(fā)明的柱、本發(fā)明的洗脫液是相同的。
[0113] 實施例
[0114] 以下通過實施例對本發(fā)明做詳細說明，但本發(fā)明不受以下實施例的限制。
[0115] [參考例1]陰離子交換柱的制備
[0116] 向帶有攪拌機的反應(yīng)器中的3重量％聚乙烯醇（日本合成化學(xué)公司制）水溶液 2000mL中，添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯（新中村化學(xué)工業(yè)公司制）200g、三乙二醇二甲 基丙烯酸酯（新中村化學(xué)工業(yè)公司制）l〇〇g、甲基丙烯酸縮水甘油酯（和光純藥工業(yè)公司 制）l〇〇g和過氧化苯甲酰（KISHIDA化學(xué)公司制）1. 0g的混合物。邊攪拌邊加熱，氮氣環(huán)境 下80°C聚合1小時。接下來，作為具有強陽離子性基團的親水性單體，將甲基丙烯酸乙基三 甲基氯化銨（和光純藥工業(yè)公司制）l〇〇g溶解于離子交換水。將其添加至相同的反應(yīng)器， 按照相同方式，邊攪拌邊在氮氣環(huán)境下80°C聚合2小時。通過用水和丙酮將得到的聚合組 合物清洗，得到表面具有親水性聚合物層的被覆聚合物粒子，其中親水性聚合物具有季銨 基團。對得到的被覆聚合物粒子，使用粒度分布測定裝置（AccuSizer780/Particle Sizing Systems公司制）進行測定，平均粒徑為10 ym。
[0117] 使得到的被覆聚合物粒子10g在離子交換水100mL中分散，準(zhǔn)備反應(yīng)前漿料。接 下來，邊攪拌該漿料，邊添加N，N-二甲基氨基丙基胺（和光純藥工業(yè)公司制）10mL，在70°C 反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后，使用離心分離機（日立制作所公司制，"Himac CR20G"），除去上 清，用離子交換水清洗。清洗后，使用離心分離機除去上清。進一步重復(fù)4次該利用離子交 換水的清洗，得到在基材粒子的表面具有季銨基團和叔氨基的離子交換色譜用填充劑。
[0118] 將上述離子交換色譜用填充劑填充于液體色譜系統(tǒng)的不銹鋼制柱（柱尺寸：內(nèi)徑 4. 6mm X 長度 20mm)。
[0119] [參考例2]樣本細胞的制備
[0120] l)LoVo、LS174T、HCT116 細胞的培養(yǎng)
[0121] 為了得到⑶KN2A基因啟動子部位（序列編號1)的100 %甲基化DNA、非甲基化 DNA、以及它們的雜合結(jié)合體DNA (半甲基化DNA)，購入具有各個狀態(tài)（status)的該啟動子 基因的3種細胞系LoVo、LS174T、和HCT116(DS Pharma Biochemical公司制）。培養(yǎng)是在適 合各個細胞的培養(yǎng)基條件下進行。LoVo是在Ham's F-12(F_12Nutrient Mixture)培養(yǎng)基中 添加 10%FBS(Fetal Bovine Serum)，在加濕室中 5%C02 存在下于 37°C 培養(yǎng)（B.Drewinko， M.M.Romsdahl，L.Y. Yang.，Cancer Res. 36,1976,467)。LS174T 是在 MEM (Minimum Essential Medium) Earle' s 培養(yǎng)基中添加 10% FBS 和 1% NEAA (Non-Essential Amino Acids)，在加濕室中 5% (：02存在下于 37°C 培養(yǎng)（B.H.Tom，L.P.Rutzky，M.M. Jakstys. In Vitro. 12,1976,180)。HCT116 是在 McCoy 's 5A Medium 培養(yǎng)基中添加 10% FBS，在加濕 室中 5% C02存在下于 37°C培養(yǎng)（M. G. Brattain，W. D. Fine，J. Thompson. Cancer Res. 41， 1981，1751)。培養(yǎng)使用75mL的細胞培養(yǎng)瓶進行，培養(yǎng)結(jié)束后的細胞按照常規(guī)的方法回收制 成團狀在-80 °C保存。
[0122] 2)DHL_9、293T 細胞的培養(yǎng)
[0123] 為了得到MTAP基因啟動子部位（序列編號5)的甲基化、非甲基化，使用具有各個 狀態(tài)（status)的該啟動子基因的2種細胞系DHL-9和293T。培養(yǎng)在適用于各個細胞的培 養(yǎng)基條件下進行。DHL-9是在Roswell Park Memorial Institute Tissue Culture Medium 1640培養(yǎng)基中添加10% (v/v)FBS、100U/mL青霉素、lOOyg/mL鏈霉素和2mmol/L L-谷 氨酰胺，在加濕室中5% (：02存在下于37°C培養(yǎng)。293T是在DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養(yǎng)基中添加10% (v/v)FBS、100U/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素，在加 濕室中5% 0)2存在下于37°C培養(yǎng)。培養(yǎng)使用75mL的細胞培養(yǎng)瓶進行，培養(yǎng)結(jié)束后的細胞 按照常規(guī)的方法回收制成團狀在-80°C保存。
[0124] [實施例1]來自樣本細胞的甲基化DNA的檢測
[0125] 1)基因組DNA的提取和亞硫酸氫鹽處理
[0126] 參考例2中培養(yǎng)的細胞系1〇￥〇、1^1741\11(：1'116、01-9、或2931'的基因組0嫩，使 用QIAamp DNA Mini Kit(50) (Qiagen公司制）從-80°C保存的細胞團提取，使用分光光度 計測定DNA濃度后，在使用前-80°C下保存。準(zhǔn)備各個基因組DNA每個1 yg，使用EpiTect Bisulfite Kit(48) (Qiagen公司制）進行亞硫酸氫鹽處理并精制。亞硫酸氫鹽處理后的 DNA，精制時視為全部被回收（20ng/iiL)，用于接下來的操作。此外將未進行亞硫酸氫鹽處 理的DNA調(diào)整為10ng/ y L用于接下來的操作。準(zhǔn)備的DNA在使用前以-20°C保存。
[0127] 2)PCR
[0128] 將1)中得到的亞硫酸氫鹽處理基因組DNA進行PCR擴增。PCR在含有模板DNA 10ng、GeneAmp 1XPCR bufTer(Life Technologies 公司制）、200iimol/L GeneAmp dNTP Mix (Life Technologies 公司制）、0.75U AmpliTaq Gold DNA 聚合酶（Life Technologies 公司制）、0. 25 y mol/L正義和反義引物的25 y L反應(yīng)液中進行。PCR中，進行94°C 10分鐘 初期熱變性后，將94°C 30秒一57°C (使用F3-R3引物時）30秒或58°C (使用F4-R3引物 時）30秒一72°C 30秒作為1個循環(huán)，持續(xù)40循環(huán)，進一步進行72°C 7分鐘的延伸反應(yīng)。 PCR結(jié)束后，在預(yù)先添加溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠中，對反應(yīng)液5yL混合loading dye solution 1 y L后上樣，進行電泳，觀察PCR擴增產(chǎn)物，確認得到目標(biāo)PCR擴增產(chǎn)物。
[0129] 3)HPLC 分析
[0130] 使用參考例1中準(zhǔn)備的陰離子交換柱，在以下條件下進行離子交換色譜，分離檢 測2)中得到的各PCR擴增產(chǎn)物。
[0131] 系統(tǒng)：LC-20A SERIS(島津制作所公司制）
[0132] 洗脫液：洗脫液A 25mm〇l/LTris鹽酸緩沖液（pH7. 5)
[0133] 洗脫液B 25mmol/LTris鹽酸緩沖液（pH7. 5) +lmol/L硫酸銨
[0134] 分析時間：分析時間10分鐘
[0135] 洗脫法：在以下的梯度條件下線性增加洗脫液B的混合比率。0分鐘（洗脫液 B40% ) - 10分鐘（洗脫液B100% )
[0136] 樣本：LoVo (甲基化DNA)PCR擴增產(chǎn)物 136bp
[0137] LSI74T (非甲基化 DNA) PCR 擴增產(chǎn)物 136bp
[0138] HCT116 (半甲基化 DNA) PCR 擴增產(chǎn)物 136bp
[0139] LoVo (甲基化 DNA) PCR 擴增產(chǎn)物 77bp
[0140] LSI74T (非甲基化DNA) PCR擴增產(chǎn)物 77bp
[0141] HCT116(半甲基化DNA)PCR擴增產(chǎn)物77bp
[0142] DHL-9 (甲基化 DNA) PCR 擴增產(chǎn)物 202bp
[0143] 293T (非甲基化DNA) PCR擴增產(chǎn)物 202bp
[0144] 流速：1. OmL/min
[0145] 檢測波長：260nm
[0146] 試樣注入量：5yL(來自LoVo、LS174T或HCT116的試樣）
[0147] 7 y L (來自 DHL-9 或 293T 的試樣）
[0148] 柱溫度40~85 °C
[0149] 對于甲基化DNA的PCR擴增產(chǎn)物和非甲基化DNA的PCR擴增產(chǎn)物的峰分離度Rs 而言，在將各峰的保留時間定義為^、^(^<^ 2)，將各峰的半峰寬定義為1_、1。12時， 根據(jù)日本藥典和JIS高效液相色譜通則的定義由以下數(shù)學(xué)式表示。
[0150] [數(shù)學(xué)式1]
[0151]
[0152] 其中，1：[!1、1:[!2、1。.5111、1。. 5112使用相同的單位。此外，關(guān)于峰半峰寬1。.511的計算方法， 將峰視為標(biāo)準(zhǔn)偏差0的正態(tài)分布時由以下數(shù)學(xué)式表不。
[0153] [數(shù)學(xué)式2]
[0154] ff0 5h= 2. 354 〇
[0155] [實驗1]⑶KN2A基因啟動子區(qū)域的甲基化解析
[0156] 按照實施例1的順序，檢測從LoVo和LS174T提取的DNA中的CDKN2A基因啟動子 區(qū)域的甲基化。PCR中，由各亞硫酸氫鹽處理DNA的⑶KN2A基因啟動子DNA (序列編號1)，使 用引物CDKN2A-F3和CDKN2A-R3(序列編號2、3)擴增136bp區(qū)域，以及使用引物CDKN2A-F4 和CDKN2A-R3(序列編號4、3)擴增77bp區(qū)域。離子交換色譜分析中柱溫度設(shè)置為40°C。 模板DNA的序列、引物的序列、擴增產(chǎn)物大小、和啟動子的序列的擴增區(qū)域中的CpG島的數(shù) 目由表1示出。離子交換色譜分析的結(jié)果由圖1和圖2示出。
[0157] [表 1]
[0158]
[0159] [實驗2]MTAP基因啟動子區(qū)域的甲基化解析
[0160] 按照實施