例1的順序，檢測從DHL-9和293T提取的DNA中的MTAP基因啟動(dòng)子區(qū) 域的甲基化。PCR中，使用引物（序列編號(hào)6、7)，將各亞硫酸氫鹽處理0嫩的奶^?基因啟 動(dòng)子DNA(序列編號(hào)5)中的202bp區(qū)域擴(kuò)增。離子交換色譜分析中的柱溫度設(shè)置為70°C。 模板DNA的序列、引物的序列、擴(kuò)增產(chǎn)物尺寸、和啟動(dòng)子的序列的擴(kuò)增區(qū)域中的CpG島的數(shù) 目由表2示出。離子交換色譜分析的結(jié)果由圖3示出。
[0161] [表 2]
[0162] 方框包圍的區(qū)域是引物結(jié)合位置，atg :翻譯起始密碼子
[0163] [實(shí)驗(yàn)3]⑶KN2A基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化解析
[0164] 按照實(shí)施例1的順序，檢測從LJWLS174T和HCT116提取的DNA中的CDKN2A基因 啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化。PCR中，與實(shí)驗(yàn)1同樣，將各亞硫酸氫鹽處理DNA的⑶KN2A基因啟動(dòng) 子DNA(序列編號(hào)1)中的136bp區(qū)域和77bp區(qū)域擴(kuò)增。離子交換色譜分析中的柱溫度設(shè) 置為40°C~85°C。
[0165] 圖4-1、圖4-2、圖5-1、圖5-2中表示來自CDKN2A基因啟動(dòng)子的100%甲基化 DNA、非甲基化DNA、和半甲基化DNA的亞硫酸氫鹽處理物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（分別為136bp 和77bp)的離子交換色譜分析的結(jié)果。離子交換色譜的柱溫度，在圖4-1、圖4-2、圖5-1 和圖 5-2 中，柱溫度為（A)40°C、（B)45°C、（C)50°C、（D)55°C、（E)60°C、（F)65°C、（G)70°C、 (H)85°C。表3中表示上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（77bp)的各柱溫度下的峰分離度Rs。
[0166] [表 3]
[0167]
[0168] 通過實(shí)驗(yàn)1~3的結(jié)果和考察
[0169] 根據(jù)利用HPLC的分析結(jié)果（圖1、2、3)，可以確認(rèn)能夠精度良好地分離檢測甲基化 DNA和非甲基化DNA。沒有甲基化的DNA，模板啟動(dòng)子序列中的CpG島的胞嘧啶通過亞硫酸 氫鹽處理被變換為尿嘧啶，PCR中作為胸腺嘧啶被擴(kuò)增。另一方面，甲基化DNA，由于CpG島 的甲基化胞嘧啶即使進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理也沒有產(chǎn)生變化，仍為胞嘧啶，因此PCR中作為 胞嘧啶被擴(kuò)增。因此，圖1、2、3示出的結(jié)果表示通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的胞嘧啶和胸腺嘧啶的 差異，甲基化DNA和非甲基化DNA被分離檢測。應(yīng)予說明，焦磷酸測序解析的結(jié)果，可確認(rèn) LoVo和DHL-9的DNA100%被甲基化。
[0170] 對于各個(gè)模板啟動(dòng)子序列的PCR擴(kuò)增區(qū)域中的CpG島的數(shù)量，用于圖1的分析 的樣品中為l〇/136bp，用于圖2的分析的樣品為7/77bp，用于圖3的分析的樣品中為 16/202bp。因此，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列中產(chǎn)生弱至10%的堿基差的程度的甲基化，利用 本發(fā)明的方法，能夠短時(shí)間內(nèi)精度良好地檢測。
[0171] 此外，如圖4-1、圖4-2、圖5-1、圖5-2和表3所示，可以確認(rèn)甲基化DNA和非甲基 化DNA的亞硫酸氫鹽處理物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的HPLC中的峰分離隨著柱溫度的上升而提高。 因此，本發(fā)明的方法中通過調(diào)節(jié)離子交換色譜分析的柱溫度，能夠精度更良好地檢測甲基 化DNA和非甲基化DNA。
[0172] [實(shí)驗(yàn)4]甲基化/非甲基化DNA混合樣品的解析
[0173] 1)甲基化/非甲基化DNA混合樣品的制備
[0174] 按照實(shí)施例1的順序，制備⑶KN2A基因啟動(dòng)子部位（序列編號(hào)1)的100%甲基 化DNA和非甲基化DNA，使用EpiTect Bisulfite Kit (48) (Qiagen公司制）進(jìn)行亞硫酸氫 鹽處理。亞硫酸氫鹽處理了的100%甲基化DNA和非甲基化DNA按照特定的比例混合，制備 甲基化/非甲基化DNA混合樣品。將各DNA按照與實(shí)驗(yàn)1同樣的順序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 136bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0175] 2) HPLC 分析
[0176] 按照實(shí)施例1的順序，進(jìn)行上述得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的離子交換色譜。柱溫度設(shè)置 為70°C。分離檢測各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，測定保留時(shí)間的峰高度。分別求出各樣品中的100%甲 基化DNA的峰高度相對于僅含有100%甲基化DNA的（甲基化DNA含有率100% )樣品的 峰高度的比率、以及各樣品中的非甲基化DNA的峰高度相對于僅含有非甲基化DNA的（甲 基化DNA含有率0%)樣品的峰高度的比率。圖6表示將各樣品DNA中的100%甲基化DNA 和非甲基化DNA的峰高度的比率相對于樣品DNA中的100%甲基化DNA含有率繪制的圖。
[0177] 如圖6所示，利用HPLC樣品DNA中的100%甲基化DNA和非甲基化DNA被明顯分 離為不同的峰，而且其峰高度的比率，與樣品DNA中各自存在比率成比例。因此，本發(fā)明方 法中通過測定HPLC的峰高度，能夠測定樣品DNA中含有的甲基化率不同的DNA的存在比 率。
[0178] [實(shí)驗(yàn)5]甲基化率不同的DNA樣品的解析
[0179] 對全長為384bp的由腺嘌呤（A)48bp、胸腺嘧啶（T) 158bp、鳥嘌呤（G) 100bp、胞嘧 啶Obp、和39個(gè)位置的CpG位點(diǎn)78bp構(gòu)成的合成DNA，合成從39個(gè)位置的CpG位點(diǎn)全部被 甲基化的DNA(100%甲基化DNA)至全部沒有被甲基化的DNA(0%甲基化DNA)的甲基化率 不同的8個(gè)DNA。應(yīng)予說明，對于50%甲基化DNA，合成甲基化位置在5'端附近、在3'端 附近、和在中央附近的3種模式的DNA。各合成DNA的甲基化率和CpG島的甲基化數(shù)由表4 示出。
[0180] [表 4]
[0181]
[0182] 對于上述8個(gè)合成DNA，按照實(shí)施例1的順序檢測甲基化。DNA甲基化率不同的 DNA(0%、25%、50%、75%、100% )的HPLC的色譜圖由圖7-1A示出，DNA甲基化位置不同的 50%甲基化DNA(隨機(jī)、5'端附近、3'端附近、中央）的HPLC的色譜圖由圖7-1B示出，HPLC 的洗脫時(shí)間（保留時(shí)間）相對于DNA甲基化率繪制的數(shù)據(jù)由圖7-2C示出。HPLC分析的洗 脫時(shí)間，相對于DNA甲基化率具有極高的相關(guān)性。進(jìn)而，對于50%甲基化DNA，能夠確認(rèn)不 依賴于甲基化位置地顯示基本相同的保留時(shí)間。因此，可知不依賴于DNA中的甲基化位置 而依賴于甲基化率來決定保留時(shí)間。因此，本發(fā)明的方法中通過測定HPLC的保留時(shí)間，能 夠測定樣品DNA中含有的甲基化率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甲基化DNA的檢測方法，其特征在于，包括以下工序（1)、⑵和（3): (1) 用亞硫酸氫鹽處理樣品DNA的工序； (2) 將該用亞硫酸氫鹽處理了的樣品DNA通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的工序；以及 (3) 將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交換色譜的工序。2. -種甲基化DNA的檢測方法，其特征在于，包括以下工序（1)、（2)和（3'）： (1) 用亞硫酸氫鹽處理樣品DNA的工序； (2) 將該用亞硫酸氫鹽處理了的樣品DNA通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的工序；以及 (3'）在45°C以上且小于90°C的柱溫度下，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交換色 譜的工序。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述離子交換色譜是陰離子交換色譜。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任1項(xiàng)所述的方法，其中，所述離子交換色譜中使用的柱填 充劑含有基材粒子，在該基材粒子的表面具有強(qiáng)陽尚子性基團(tuán)和弱陽尚子性基團(tuán)這兩種基 團(tuán)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任1項(xiàng)所述的方法，其中，所述離子交換色譜中，所述PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物的洗脫所使用的洗脫液含有反離液離子。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任1項(xiàng)所述的方法，其中，所述反離液離子是硫酸根離子和銨 根離子中的任一種或兩種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任1項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步包括以下工序：將用亞硫酸 氫鹽處理所述樣品DNA而得的產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交換色譜得到的檢測信號(hào)，與 用亞硫酸氫鹽處理與所述樣品DNA的堿基序列相同但沒有甲基化的DNA而得的產(chǎn)物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交換色譜得到的檢測信號(hào)進(jìn)行比較，或者與用亞硫酸氫鹽處理與所述樣 品DNA的堿基序列相同且甲基化的比例已知的DNA而得的產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交 換色譜得到的檢測信號(hào)進(jìn)行比較。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，進(jìn)一步包括以下工序：基于所述比較的工序的結(jié) 果，測定所述樣品DNA中甲基化DNA有無存在、甲基化率或存在比率。9. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任1項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步包括以下工序：從用亞硫酸 氫鹽處理所述樣品DNA而得的產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交換色譜得到的檢測信號(hào)中， 減去用亞硫酸氫鹽處理與所述樣品DNA的堿基序列相同但沒有甲基化的DNA而得的產(chǎn)物的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的由離子交換色譜得到的檢測信號(hào)，得到差值數(shù)據(jù)。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，進(jìn)一步包括以下工序：基于所述差值數(shù)據(jù)，測定 所述樣品DNA中甲基化DNA有無存在、甲基化率或存在比率。11. 一種從樣品DNA的信號(hào)提取甲基化DNA的信號(hào)的方法，其特征在于，包括以下工序 ⑴~（6): (1) 用亞硫酸氫鹽處理樣品DNA的工序； (2) 將該用亞硫酸氫鹽處理了的樣品DNA通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的工序； (3) 將工序（2)中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交換色譜的工序； (4) 用亞硫酸氫鹽處理與該樣品DNA的堿基序列相同但沒有甲基化的DNA，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的工序； (5) 將工序⑷中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交換色譜的工序；以及 (6)從工序（3)中得到的色譜檢測信號(hào)中減去工序（5)中得到的色譜檢測信號(hào)而得到 差值數(shù)據(jù)的工序。12. 離子交換色譜用柱在甲基化DNA檢測中的使用，所述離子交換色譜用柱填充有柱 填充劑，所述柱填充劑含有在表面具有強(qiáng)陽尚子性基團(tuán)和弱陽尚子性基團(tuán)這兩種基團(tuán)的基 材粒子。13. 離子交換色譜用洗脫液在甲基化DNA檢測中的使用，所述離子交換色譜用洗脫液 含有反離液離子。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種迅速且簡便的甲基化DNA的檢測方法。一種甲基化DNA的檢測方法，其特征在于，包括以下工序：(1)用亞硫酸氫鹽處理樣品DNA的工序；(2)將該用亞硫酸氫鹽處理了的樣品DNA通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的工序；以及(3)將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于離子交換色譜的工序。
【IPC分類】C12M1/34, C12Q1/68, C12N15/09
【公開號(hào)】CN105074010
【申請?zhí)枴緾N201480018778
【發(fā)明人】與谷卓也, 登勉
【申請人】積水醫(yī)療株式會(huì)社, 國立大學(xué)法人三重大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2014年3月7日
【公告號(hào)】WO2014136930A1