一株耐微波枯草芽孢桿菌及其在納豆激酶制備中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株耐微波枯草芽孢桿菌及其在納豆激酶制備中的應(yīng)用，屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們生活節(jié)奏的加快和飲食習(xí)慣的調(diào)整，血栓性疾病的發(fā)病率大大提高，嚴(yán) 重威脅著人類的健康與生命安全，每年死于腦梗塞、心肌梗死的病人多達(dá)幾百萬，居各種疾 病之首。目前，治療心腦血管疾病的首選方法是溶解血栓，因此，具有高纖溶活性溶栓藥物 (如納豆激酶）的研發(fā)成為研究熱點之一。
[0003] 納豆激酶是納豆（natto)在發(fā)酵過程中由枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis) 產(chǎn)生的具有高纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，該酶不但具有顯著的溶栓活性，還可以激活體內(nèi) 的纖溶酶原，增加內(nèi)源性溶纖酶的含量，具有降血壓、抗氧化、抗腫瘤及溶血栓等多種醫(yī)療 功效，而且與傳統(tǒng)的溶栓制劑相比，納豆激酶有不易引起出血、無抗原性、半衰期長、安全無 毒、成本低廉及口服有效等優(yōu)點，因而具有開發(fā)為預(yù)防心腦血管疾病保健食品的潛力。自 1987年被Dr.Sumi首次從納豆中分離出來后，納豆激酶便受到世界相關(guān)研究人員的廣泛關(guān) 注。
[0004] 與此同時，由于飲食習(xí)慣、工作壓力以及環(huán)境等的影響，腸道疾病的發(fā)病率也有逐 年增高之勢，給人們的生活和工作造成了重大影響。腸道微生物又稱人類的第二套基因組， 與多種腸道疾病如代謝性疾病、免疫性疾病甚至腫瘤的發(fā)生都有直接關(guān)系。因此，改善腸道 微環(huán)境、調(diào)節(jié)腸道菌群是預(yù)防和治療腸道疾病的關(guān)鍵，而腸道益生菌也是21世紀(jì)新型藥物 研發(fā)的方向。
[0005] 納豆激酶發(fā)酵菌株一一枯草芽孢桿菌是人體益生菌，其活菌劑對人體具有多種生 物功能。首先，枯草芽孢桿菌可以抑制致病菌生長，促進益生菌生長，從而改善腸道微生態(tài) 環(huán)境，預(yù)防痢疾、腸炎、便秘等腸道疾病；其次，枯草芽孢桿菌通過分泌有機酸、細(xì)菌素等，可 以增強機體免疫功能；再者，枯草芽孢桿菌在腸道內(nèi)增殖，可以調(diào)節(jié)機體腸道代謝；最后， 枯草芽孢桿菌通過分泌各種酶和維生素類物質(zhì)，能夠促進腸道營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。
[0006] 而在現(xiàn)有納豆激酶產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的過程中，由于發(fā)酵產(chǎn)物的干燥需要用到微波 真空干燥設(shè)備，該干燥過程會殺死大部分發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌活菌，因此，納 豆激酶產(chǎn)品中枯草芽孢桿菌活菌含量不高。如果能篩選出一株耐微波的納豆激酶高產(chǎn)菌 株，就可以得到富含枯草芽孢桿菌活菌的納豆激酶產(chǎn)品，該產(chǎn)品不但具有納豆激酶產(chǎn)品的 降壓、溶栓等功效，還含有豐富的枯草芽孢桿菌活菌，從而起到改善腸道功能、預(yù)防和治療 腸道疾病的作用，其未來的發(fā)展前景不言而喻，但目前國內(nèi)還沒有相關(guān)方面的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一株耐微波枯草芽孢桿菌及其在納豆激酶制備中的應(yīng)用，以 解決納豆激酶生產(chǎn)過程中由于枯草芽孢桿菌不耐微波輻射，而不易得到富含枯草芽孢桿菌 活菌的納豆激酶產(chǎn)品（納豆膠囊）的技術(shù)問題。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一株耐微波枯草芽孢桿菌， 所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)LB-18,保藏單位：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號： CGMCCNO. 10835,保藏日期：2015 年 5 月 22 日。
[0009] 本發(fā)明從豆豉中篩選出耐微波枯草芽孢桿菌菌株LB-18,采用本發(fā)明的菌株，可以 獲得具有高纖溶活性且富含枯草芽孢桿菌活菌的納豆激酶產(chǎn)品（納豆膠囊）。實驗結(jié)果 表明，本發(fā)明菌株生產(chǎn)的納豆激酶產(chǎn)品纖溶活性可達(dá)2800FU/g ;枯草芽孢桿菌活菌含量為 1. 26 X IO8個/g，是現(xiàn)有納豆激酶發(fā)酵產(chǎn)物的幾倍。
[0010] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一株枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)富含枯草芽孢桿 菌活菌的高纖溶活性納豆激酶產(chǎn)品方面的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一株枯草芽孢桿菌生產(chǎn)富含枯草芽孢桿菌 活菌的高纖溶活性納豆激酶的方法，包括以下步驟：
[0012] (1)從斜面挑取枯草芽孢桿菌LB-18接種于LB液體種子培養(yǎng)基，25-40°C條件下， 120-180r/min搖床恒溫培養(yǎng)12-18h，得到枯草芽孢桿菌種子液；
[0013] (2)將黃豆浸泡過夜，瀝干水分，高壓滅菌，冷卻至室溫后，按照1-8%的接種量接 種枯草芽孢桿菌種子液，25-40°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)36-72h;
[0014] (3)將步驟⑵的黃豆發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物微波真空干燥，粉碎，過80-120目篩即得。
[0015] 所述LB液體種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原料：蛋白胨1%，酵母粉0.5%， NaCll%;pH6.8，121°C高壓滅菌 20min。
[0016] 所述微波真空干燥設(shè)備的干燥條件為：干燥溫度彡40°C，真空度-0.06MPa，微波 功率8kW，微波頻率2450 ± 50MHz，干燥時間3-8h。
[0017] 采用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)納豆激酶產(chǎn)品，不但可以得到具有高纖溶活性的 納豆激酶，而且還是一種富含枯草芽孢桿菌的活菌制劑，從而既有降壓、溶栓等功效，還有 改善腸道功能、提高機體免疫力的作用，為納豆激酶作為功能性食品和保健食品的研發(fā)提 供了新的思路，使其具有更為廣闊的開發(fā)前景。同時，本發(fā)明采用黃豆為原料，來源豐富易 取，成本低，無環(huán)境污染，所用設(shè)備、試劑價格便宜，便于規(guī)?；a(chǎn)。
【附圖說明】
[0018] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細(xì)說明。
[0019] 圖1為本發(fā)明菌株LB-18及其他納豆激酶生產(chǎn)菌株用不同劑量C〇60輻照后的存 活率；
[0020] 圖2為本發(fā)明菌株LB-18及其他納豆激酶生產(chǎn)菌株用不同時間微波照射后的存活 率。
【具體實施方式】
[0021] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細(xì)說明。
[0022] 實施例1納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選
[0023] I. 1納豆激酶高產(chǎn)菌株的初篩取市售豆豉，稱取樣品10g，加入IOOmL無菌水中， 充分振蕩打散，100°c沸水煮沸5min，靜置片刻，取上層混濁液，梯度稀釋后，分別取100iiL不同稀釋度的溶液，均勻涂布于LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)，挑單菌落進行劃線培養(yǎng)，連續(xù)兩 次。挑取LB分離平板上的單菌落點種到纖維蛋白平板上，37°C培養(yǎng)18h，測量溶解圈直徑， 溶解圈較大的菌株液體發(fā)酵進行復(fù)篩。
[0024] 1. 2納豆激酶高產(chǎn)菌株的復(fù)篩將初篩溶解圈直徑較大的菌株，用LB種子培養(yǎng)基活 化（37°C、150r/min、過夜），按照5%的接種量分別接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計： 6%大豆粉，2%葡萄糖，0.06%CaCl2,0.07%MgS04,pH6.5)中，37°C發(fā)酵 72h，發(fā)酵產(chǎn)物用 0. 05M、pH7. 4的磷酸緩沖液稀釋，取稀釋液10yL，加樣于纖維蛋白平板上37°C恒溫培養(yǎng) 18h，測定溶解圈直徑，選取溶解圈較大的菌株，進行耐輻射菌株的篩選。
[0025] 實施例2耐輻射納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選
[0026] 2. 1亞硝基胍誘變?nèi)?fù)篩后產(chǎn)納豆激酶活性相對較高的菌株，接種于液體LB培 養(yǎng)基中，37°C、150r/min、過夜培養(yǎng)后，重新轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中（接種量1% )，37°C、 150r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期（約5_8h)，鏡檢觀察菌體形態(tài)后，8000r/min離心5min 收集菌體，用滅菌的0. 1M、pH7. 0的磷酸鈉鹽緩沖液（PBS)洗滌菌體后，重新懸浮于0.IM PBS緩沖液中（使細(xì)菌濃度為IO6-IO8個/mL)，加入2mg/mL亞硝基胍（NTG)溶液（用0? 1M、 pH7. 0的PBS配制），使其終濃度為0? 2mg/mL，35°C、150r/min搖床誘變Ih后，用0?lM、pH7. 0 PBS洗滌3次除去NTG，菌體重新懸浮于PBS中。
[0027] 2. 2耐Co6°輻照納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選將NTG誘變后重懸于PBS中的菌體用 Co6°輻照，第一次輻照劑量為IOOGy;照射后梯度稀釋涂LB平板，計算致死率；隨后離心收 集菌體，加入滅菌LB液體培養(yǎng)基，37°C、150r/min搖床重新培養(yǎng)至對數(shù)后期（約5h)，鏡檢 觀察菌體形態(tài)后，收集菌體，并將其重懸于PBS緩沖液中，進行第二次Co6°輻照（劑量逐漸 增加），如此反復(fù)進行Co6°輻照，所用劑量依次為100、200、400、600、800、1000 Gy。經(jīng)Co6°反 復(fù)輻照后，得到一株耐Co6°照射的菌株LB-18 (結(jié)果見附圖1)。
[0028] 2. 3菌株LB-18耐微波性能測定將菌株LB-18接種到滅過菌的LB液體培養(yǎng)基， 37°C、150r/min搖床重新培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 9%NaCl洗滌2次后，用質(zhì)量 分?jǐn)?shù)0. 9 %NaCl重懸，稀釋至IO8個細(xì)胞/mL，取ImL菌液加入9mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)9 %NaCl，混勻 后置于冰塊上，調(diào)至中等火力，進行微波輻照，輻照時間分別為3、5、7min，每個樣品設(shè)3個 重復(fù)，輻照后梯度稀釋涂LB平板，計算細(xì)菌存活率，用納豆激酶生產(chǎn)菌株DC-Tx和R作對照 (結(jié)果見附圖2)。
[0029] 菌株LB-18的特征如下：
[0030] 形態(tài)特征：
[003