耐受高濃度葡萄糖的葡萄球菌CGMCC No.10671及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及葡萄球菌的新的菌株以及該菌株的應用。
【背景技術】
[0002] 乙偶姻和2, 3- 丁二醇是兩種重要的化學品，在乙偶姻還原酶的還原作用下，乙偶 姻可以被還原為2,3_ 丁二醇。該兩種化合物常常被細菌聯產。乙偶姻是一種廣泛使用的食 用香料，也可以被應用到其它很多行業(yè)，但是目前市場上的乙偶姻大部分是由化學合成法 生產的，不符合食品安全的需要，同時該方法對環(huán)境也有較大的污染。為了滿足食品安全、 環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展的需要，微生物法發(fā)酵生產乙偶姻的水平需要得到進一步的提高。 2, 3- 丁二醇是一種重要的生物燃料，由于微生物能夠較好的耐受2, 3- 丁二醇，因此該燃料 受到科研工作者的高度重視。開發(fā)能夠生產乙偶姻和2, 3-丁二醇的高效菌株具有較高的 理論研究和應用價值。
[0003] 在前期研究中，已經發(fā)現多個菌株能夠合成乙偶姻。Hespell等人以木聚糖、玉米 纖維、糖類底物利用多粘芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa)發(fā)酵最高可生產大約11.lgL1的 乙偶姻：Cho等人篩選到一株產酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca)Ml，發(fā)現對該菌發(fā)酵 過程中pH進行控制，可以影響到產物中乙偶姻和2,3_ 丁二醇的比例，并發(fā)現該菌中催化乙 偶姻到2, 3-丁二醇的關鍵酶基因受到pH誘導：Fan等人在日本納豆中篩選到可以生產乙 偶姻的B.subtilis，在搖瓶中單獨培養(yǎng)該菌可得到大約33. 90gL1的乙偶姻；Xiao等人篩 選到耐熱的芽孢桿菌，可以在最適45°C條件下生產乙偶姻和2, 3-丁二醇；Xu等人篩選到一 株高產乙偶姻的B.subtilis，并利用誘變的方法將乙偶姻產量提高到46. 9gL%江南大學 李華鐘等人篩選到一株高產乙偶姻的B.subitlis，該菌株可以生產大約42. 2gL1的乙偶 姻。上述報道集中在芽孢菌以及克雷伯氏菌中，開發(fā)具有較好性能的新菌株既有較好的理 論研究價值和應用意義。此外，葡萄糖的耐受度是菌株工業(yè)應用前景的一個重要指標，具有 較好的葡萄糖耐受度的菌株既能夠耐受高濃度的底物，同時也能夠耐受高濃度的滲透壓， 對于提高產物的濃度具有重要意義。因此，本發(fā)明的目的是，提供一種新的耐受高濃度葡萄 糖的葡萄球菌，并且利用該菌株生產乙偶姻和2, 3- 丁二醇的方法。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明針對目前以葡萄糖為原料合成乙偶姻的菌株來源窄，特別是工業(yè)菌株 的高濃度葡萄糖耐受性需要提升的現狀，篩選獲得高濃度葡萄糖耐受性的葡萄球菌 (Staphylococcussp.)，并且利用該菌株生產乙偶姻和2, 3- 丁二醇的方法。
[0005] -種耐受高濃度葡萄糖的葡萄球菌（Staphylococcussp.)，其保藏編號為：CGMCC No. 10671，保藏日期為2015年3月30日。
[0006] 所述CGMCCNo. 10671葡萄球菌是從湖南永州白芒煙草試驗站煙田土壤中通過選 擇性培養(yǎng)基分離得到的。
[0007] 其具有如下生物學特征：
[0008] 球形或稍呈橢圓形，直徑1.0ym左右，排列成葡萄狀。無鞭毛，不能運動，無芽胞， 革蘭氏染色為陽性。在LB固體培養(yǎng)基表面，菌體形成不透明的淺黃色小菌落，菌落干，邊緣 整齊。
[0009] 上述葡萄球菌菌株的經通用引物PCR獲得16SrDNA序列與其它多株葡萄球菌的 16SrDNA序列有99%的相似性但是不同。
[0010] 其中上述PCR的引物為fDl:AGAGTITGATCCTGGCTCAG，
[0011] rP2 ：CGGCTACCTTGTTACGACTT〇
[0012] 進一步的，本發(fā)明還公開了CGMCCNo. 10671的葡萄球菌的應用方法，具體為利 用保藏編號為：CGMCCNo. 10671的葡萄球菌在耐受高濃度的糖的情況下生產乙偶姻和2， 3_ 丁二醇。
[0013] 所述葡萄球菌能夠在高葡萄糖濃度的乙偶姻篩選培養(yǎng)基里快速生長并產生乙偶 姻和2, 3-丁二醇；
[0014] 耐受高濃度葡萄糖產乙偶姻的菌株的篩選配方：胰蛋白胨8~20g/l，牛肉膏 2 ~10g/l，NaCl3 ~6g/l，葡萄糖 300 ~500g/L，pH值 7. 0 ~7. 4,最佳溫度為 30 ~37°C，
[0015] 培養(yǎng)時的轉速為100~140r/min，
[0016] 生產乙偶姻和2, 3, - 丁二醇的菌株培養(yǎng)在250ml的三角瓶中的裝液量為40~ 80ml，
[0017] 生產乙偶姻和2, 3- 丁二醇的培養(yǎng)時間為36~48小時，
[0018] 生產乙偶姻和2, 3-丁二醇的培養(yǎng)基的滅菌條件為110~120°C滅菌20~30分 鐘。
[0019] 進一步的，按照所述葡萄球菌能夠在高葡萄糖濃度的乙偶姻篩選培養(yǎng)基里快速生 長并產生乙偶姻和2, 3- 丁二醇的操作方法，
[0020] 該葡萄球菌能夠在含有500g/L的葡萄糖的培養(yǎng)基中生長，在搖瓶發(fā)酵水平上能 夠產生至少45g/L的乙偶姻和至少12. 5g/L的2, 3- 丁二醇。
[0021] 進一步的，生產乙偶姻和2,3_ 丁二醇的復合氮源還可以為：酵母浸膏、氯化銨、尿 素等，碳源還可以為：蔗糖、果糖麥芽糖等。即利用上述耐受高濃度葡萄糖的葡萄糖菌生產 乙偶姻和2,3_ 丁二醇的的復合氮源可以是牛肉膏或蛋白胨，但不局限于牛肉膏和蛋白胨， 碳源為葡萄糖，單不僅限于葡萄糖。
[0022] 本發(fā)明的葡萄糖菌株是一種分離的全新的菌株，該菌株該菌株具高濃度葡萄糖耐 受性，能夠耐受葡萄糖濃度高達500g/L。該菌株發(fā)酵過程中合成產物比較單一，主要為乙偶 姻和2, 3-丁二醇，利于進行后期的基因工程改造和發(fā)酵生產。葡萄糖的耐受度是菌株工業(yè) 應用前景的一個重要指標，具有較好的葡萄糖耐受度的菌株既能夠耐受高濃度的底物，同 時也能夠耐受高濃度的滲透壓，對于提高產物的濃度具有重要意義。
[0023] 保藏信息：
[0024] 菌株名稱：葡萄球菌（Staphylococcussp.)
[0025] 參據的生物材料（株）CAS-513-86-0-HNYZ
[0026] 保藏日期：2015年3月30日
[0027] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)
[0028] 保藏編號：CGMCCNo. 10671
[0029] 地址：北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
【附圖說明】
[0030] 圖1篩選獲得菌株的高濃度葡萄糖耐受性。
[0031] 圖2搖瓶發(fā)酵葡萄球菌生產乙偶姻和2, 3- 丁二醇。[乙偶姻和2, 3- 丁二醇的氣 相-質譜鑒定（a-乙偶姻；b. 2, 3- 丁二醇）]
【具體實施方式】
[0032] 一、菌株篩選
[0033] L培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：
[0034] 耐受高濃度葡萄糖產乙偶姻的菌株的篩選配方為：胰蛋白胨3~8g/l，牛肉膏 2 ~5g/l，NaCl3 ~5g/l，MgS04.7H20,2 ~4g/l，葡萄糖 300 ~500g/l，pH值 7. 0 ~7. 4。 最佳溫度為30~37 °C，轉速為100~140r/min，在250ml的三角瓶中的裝液量為40~ 80ml〇
[0035] 培養(yǎng)時間為24~36小時。
[0036] 上述煙培養(yǎng)基的滅菌條件為112°C滅菌30分鐘。
[0037] 上述培養(yǎng)基中添加1 %~1. 5%的瓊脂制備成固體培養(yǎng)基用于菌株篩選。2.篩選 方法：
[0038] 取污水、污泥以及腐敗生物質的土壤按照lg樣品5ml水溶解，將水樣置于室溫24 小時活化然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均 勾，以此類推制成10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、10 6不同稀釋度的土壤。
[0039] 取不同濃度的稀釋土壤菌液涂布到以添加1%~1. 5%的瓊脂的含有高濃度葡萄 糖的培養(yǎng)基制成的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上，
[0040] 上述菌落的產乙偶姻篩選方法為：將10%NaOH、5 % 1-萘酚（正丙醇溶解）、0. 5% 肌酸的溶液按照1 : 1 : 1的比例混合，并與加熱后熔化的固體LB培養(yǎng)基混勻（顯色液加 入量約占培養(yǎng)基總體積的10% )，然后倒于長有目標菌落且含有高濃度葡萄糖的平板上， 等待半小時觀察顏色變化。
[0041] 上述篩選獲得菌株，培養(yǎng)36小時后挑取單菌落進行液體培養(yǎng)，葡萄糖耐受性試 驗。經篩選共獲得菌株4余株，進行搖瓶培養(yǎng)后測定乙偶姻和2, 3- 丁二醇的產量。
[0042] 二、葡萄糖耐受性的驗證
[0043] 取上述菌株篩選培養(yǎng)基，按照1~5%的接種量接種活化后的葡萄球菌，接種于裝 有2mlLB培養(yǎng)基的試管中，生長到菌體密