一種植物線粒體dna的快速提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物線粒體DNA的快速提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]線粒體是植物細(xì)胞的重要細(xì)胞器，它是自身具有一定遺傳功能結(jié)構(gòu)的基因組，能夠自我復(fù)制，可編碼一些呼吸代謝過(guò)程中的重要酶成分，為細(xì)胞生理活動(dòng)提供能量。線粒體作為細(xì)胞能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的中樞，在細(xì)胞合成、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及信息傳遞中起著重要作用。另外，對(duì)許多高等植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育研究表明，線粒體與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有密切關(guān)系，是雄性不育因子的重要載體。研究線粒體DNA(mtDNA)的結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)作物改良，探索細(xì)胞器的起源和進(jìn)化，特別在植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究、不同雄性不育的細(xì)胞質(zhì)分類上有重要的意義。
[0003]提取尚質(zhì)量的線粒體DNA是對(duì)線粒體遺傳系統(tǒng)進(jìn)彳丁深入研究的基本如提。植物線粒體DNA與核DNA相比，在細(xì)胞內(nèi)含量甚微，提取過(guò)程中極易被核及葉綠體DNA污染。另夕卜，植物mtDNA大多數(shù)為環(huán)狀分子，每個(gè)線粒體中DNA分子數(shù)從幾拷貝到幾十拷貝不等，且不同物種mtDNA分子大小差別很大，從幾十kb到幾千kb不等，所對(duì)應(yīng)的mtDNA提取方法也不同。總體來(lái)看，植物mtDNA提取方法，主要有密度梯度離心和差速離心等方法。密度梯度離心得到的線粒體DNA純度高，但操作復(fù)雜、耗時(shí)、對(duì)材料的需求量大、產(chǎn)率低；普通差速離心操作簡(jiǎn)單，但所提取的mtDNA純度低，易降解，核DNA、RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染嚴(yán)重。這些不利因素的制約導(dǎo)致現(xiàn)有的線粒體提取方法不能滿足后續(xù)研究工作的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種植物線粒體DNA的快速提取方法，該方法能高效、簡(jiǎn)單、快速得獲得高質(zhì)量的線粒體DNA，可以滿足PCR擴(kuò)增、定量和定性分析、測(cè)序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種植物線粒體DNA的快速提取方法，其特征是，具體包括下述步驟:
[0006](I)溶液配制
[0007]Buffer Α:0.4Μ 蔗糖，5mM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM Tris-HCl，1mM 三甲基甘氨酸，8mM半胱氨酸，0.1% BSA(牛血清白蛋白)和I % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH 7.8 ;
[0008]Buffer B:0.4M 蔗糖，ImM EDTA, 1mM Tris-HCl，0.1% BSA, ρΗ7.2 ；
[0009]溶液Wl:1%葡萄糖，50mM EDTA，25mM Tris-HCl, ρΗ8.0 ；
[0010]溶液W2:0.2mM NaOH，I % SDS (十二烷基硫酸鈉);
[0011 ]溶液 W3:5mol/L KAC (醋酸鉀)，ρΗ4.8 ；
[0012]漂洗液WT:70%酒精；
[0013]洗脫緩沖液TB:10mM Tris-HCl, ImM EDTA, PH = 8.0 ；
[0014]備注:其中，70%酒精的百分?jǐn)?shù)為體積比，其余百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量體積比w/v(即g/ml) ο
[0015]⑵預(yù)處理
[0016]取植物新鮮幼嫩組織于4°C環(huán)境中暗處理24h，在預(yù)冷(預(yù)冷至2-4°C )的蒸餾水中清洗材料[若需消毒，在終濃度為0.7% (w/v)的次氯酸鈉稀釋液中浸泡5min];材料預(yù)處理后立即進(jìn)行提取，以避免細(xì)胞膨脹壓力及獲得最大量的線粒體，下述步驟均需在2-4°C下進(jìn)行；
[0017]⑶研磨
[0018]在預(yù)冷的研缽中加入Buffer A，再加入預(yù)處理的材料進(jìn)行研磨；研磨后通過(guò)4_8層的醫(yī)用紗布過(guò)濾，收集過(guò)濾液并保持其pH在7.0以上(若不足，用NaOH調(diào)整)；
[0019](4)分離線粒體
[0020]將收集液于4°C，100g離心5± lmin，收集上清；4°C，12000g離心20±2min，棄掉上清；加入Buffer B，用軟毛筆重懸綠色沉淀顆粒；然后4°C，100g離心5± lmin，收集上清 MADNase I，放置 l_2h ;加入 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)，混勻后靜止 10±2min，終止反應(yīng)-A°C，12000g離心20±2min，棄掉上清；
[0021](5)提取線粒體DNA
[0022]向沉淀中加入溶液Wl懸浮沉淀；然后加入溶液W2，溫和顛倒6-8次，再加入溶液W3，溫和顛倒離心管，充分混勻溶液；離心10±2min，吸取上清放入吸附柱(帶有核酸硅膠膜的硅膠膜離心吸附柱)中，再離心，倒掉廢液；向吸附柱中先后2次加入漂洗液WT，離心漂洗吸附柱；最后將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位滴加洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，離心2_3min，將溶液收集到離心管中，_20°C保存。
[0023]進(jìn)一步地，所述步驟(3)所使用的Buffer A，若為非綠色組織，則比例為2ml/g ;若為綠色組織，4ml/g。
[0024]進(jìn)一步地，所述步驟⑷的Buffer B用量為40ml/g(材料)；優(yōu)選的，先加入Buffer B5-10ml/g，用軟毛筆重懸綠色沉淀顆粒；將重懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入Buffer B 至 40ml/g。DNase I 的用量為終濃度為 40 μ g/ml，0.5mol/L EDTA 的用量為 ImL/g (材料)。
[0025]進(jìn)一步地，所述步驟(5)中離心的離心速度均為10000-15000g，優(yōu)選為12000g。
[0026]進(jìn)一步地，所述步驟(5)吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中滴加洗脫緩沖液TB前，再 12000g 離心 2min。
[0027]進(jìn)一步地，所述步驟(5)每Ig材料，采用2ml溶液Wl懸浮后，加入250 μ I溶液W2和350 μ I溶液W3。
[0028]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0029]1、本發(fā)明Buffer A中鹿糖可以維持滲透壓，EDTA提供二價(jià)陽(yáng)離子，Tris-HCl提供緩沖區(qū)間，該配方可以為植物組織提供穩(wěn)定的PH值和滲透壓，最大程度保證植物細(xì)胞中線粒體的完整性；更重要的是Buffer A中加入三甲基甘氨酸和半胱氨酸，產(chǎn)率提高，線粒體DNA無(wú)明顯降解；
[0030]2、材料研磨后保持PH7.0以上，產(chǎn)率和質(zhì)量得到提高；
[0031]3、由于步驟(4)中Buffer B中加入0.1 % BSA,具有維持穩(wěn)定pH值和滲透壓的作用，故而產(chǎn)率和質(zhì)量得到提高；
[0032]4、由于步驟(4)中離心力為1000g，可以更好的將細(xì)胞壁殘留組織與粗線粒體分離開；
[0033]5、由于步驟(5)中使用溶液W1、W2、W3和吸附柱提取線粒體DNA，處理時(shí)間由4_5h變?yōu)?0min，大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，但產(chǎn)率和質(zhì)量無(wú)明顯變化。
[0034]綜上，本發(fā)明能高效(提取效率由現(xiàn)有的0.1yg mtDNA/g組織提高一倍到0.2ygmtDNA/g植物組織)、快速(提取時(shí)間由6-7h縮短為3_4h)得獲得高質(zhì)量(凝膠電泳檢測(cè)mtDNA為明亮清晰條帶)的植物線粒體DNA，可以滿足PCR擴(kuò)增、定量和定性分析、測(cè)序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。
【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1為5個(gè)線粒體DNA凝膠電泳圖；
[0036]圖2為以兩種方法提取的線粒體DNA為模板的PCR凝膠電泳對(duì)比圖；其中，A1-A5為本發(fā)明所述提取方法得到的線粒體DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為傳統(tǒng)方法(普通差速離心)提取的線粒體DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1
[0038](I)溶液配制
[0039]Buffer Α:0.4Μ 蔗糖，5mM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM Tris-HCl，1mM 三甲基甘氨酸，8mM半胱氨酸，0.1% BSA(牛血清白蛋白)和I % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH 7.8 ;
[0040]Buffer B:0.4M 蔗糖，ImM EDTA, 1mM Tris-HCl, 0.1% BSA, ρΗ7.2 ；
[0041]溶液Wl:1%葡萄糖，50mM EDTA，25mM Tris-HCl, ρΗ8.0 ；
[0042]溶液W2:0.2mM NaOH, I % SDS (十二烷基硫酸鈉);
[0043]溶液W3:5mol/L KAC (醋酸鉀)，ρΗ4.8 ；
[0044]漂洗液WT:70%酒精；
[0045]洗脫緩沖液TB:10mM Tris-HCl, ImM EDTA, PH = 8.0 ；
[0046](2)組織預(yù)處理:
[0047]取Ig蘿卜新鮮幼嫩組織于4°C環(huán)境中暗處理24h，在預(yù)冷(預(yù)冷至2-4°C )的蒸餾水中清洗材料(若需消毒，在終濃度為0.7%的次氯酸鈉稀釋液中浸泡5min);
[0048](3)研磨:
[0049]材料一旦準(zhǔn)備完畢需立即進(jìn)行提取，以避免細(xì)胞膨脹壓力及獲得最大量的線粒體，所有步驟均需在2_4°C下進(jìn)行，不要在大于4°C的環(huán)境中或延長(zhǎng)步驟中的操作時(shí)間間隔。
[0050]在預(yù)冷的研缽中加入Buffer A，研磨材料；通過(guò)4_8層的醫(yī)用紗布過(guò)濾勻漿，收集過(guò)濾液；最后通過(guò)擠壓過(guò)濾用的紗布合并收集液于50ml的離心管中，均一化的濾液需要保持pH在7.0以上，若不足，用NaOH調(diào)整；所使用的Buffer A若為非綠色組織，則比例為2ml/g ;若為綠色組織，4ml/g ；
[0051](4)分離線粒體:
[0052]將收集液于4°C，100g離心5min，收集上清；然后4°C，12000g離心20min，棄掉上清；加入Buffer B 5_10ml，用軟毛筆重懸綠色沉淀顆粒；