rng)等人(2002) “斑馬魚:用于藥物篩選的臨床前模型(Zebrafish:a preclinical model for drug screening.) ”；《分析與藥物開發(fā)技術(shù)》(Assay Dev.Technol.) 1:41_48 ;馬奎斯(Marques)等人(2009) “在斑馬魚異種移植模型中原發(fā)性人類腫瘤的轉(zhuǎn)移行為(Metastatic behav1r of primary human tumours in azebrafish xenotransplantat1n model.)，，《BMC 癌癥》(BMC Cancer)9:128)。
[0012]在斑馬魚中的操作是在其生長的各個階段進(jìn)行，不過常常使用受精后48小時(hours post fertilizat1n，hpf)并且這是特別優(yōu)選用于操作的階段之一。在大規(guī)模遺傳研究、藥物篩選和毒性研究，以及癌細(xì)胞分析期間處理許多斑馬魚胚胎所需的時間和人力通常是大部分實(shí)驗(yàn)室的限制因素。然而，目前尚無可商購的用于48hpf斑馬魚胚胎的多孔顯微注射系統(tǒng)，這主要是因?yàn)榘唏R魚胚胎較長并且奇怪的形狀。
[0013]在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中眾所周知自動多孔顯微注射系統(tǒng)，其中這些系統(tǒng)主要被用于如DNA、RNA1、蛋白質(zhì)或甚至其它細(xì)胞(如精子)等材料的核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。自動系統(tǒng)能夠以可再現(xiàn)的一致性和準(zhǔn)確性進(jìn)行大量顯微注射，而這通常是難以手動實(shí)現(xiàn)的。
[0014]因此，為了對原發(fā)腫瘤細(xì)胞和CTC進(jìn)行特征分析和表征，需要一種在動物模型中體內(nèi)產(chǎn)生并生長腫瘤細(xì)胞的方法。此方法可以允許對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥物測試，并且可以提供針對患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的靶向療法。此外，本領(lǐng)域中還需要一種能夠高效操作和注射48hpf斑馬魚胚胎用于遺傳、毒性、藥物及癌癥研究的系統(tǒng)。
[0015]現(xiàn)有技術(shù)
[0016]專利文獻(xiàn)
[0017]斯蒂芬妮E.高斯(Stephanie E.Gaus)在2004年8月20日提交的題為“網(wǎng)底多孔板(Meshwell Plates) ” 的美國專利申請?zhí)?10/923，253 (或 US2005/0112030A1)中披露了一種多孔板，如96孔板，其底部尖端被去除并且用帶有開口的網(wǎng)代替，由此允許快速排干溶液并防止孔間溶液的“芯吸作用”。預(yù)計(jì)所陳述的“網(wǎng)底多孔板”特別適用于分析斑馬魚胚胎。
[0018]阿方索古特-雷茲亞當(dāng)(Alfonso Gutier-Rez Adan)等人在2005年5月12日提交的題為“有關(guān)胚胎和/或細(xì)胞操作的補(bǔ)充(Supplementat1n for Embryo and/or CellManipulat1n) ”的PCT專利申請?zhí)朠CT/ES2005/000255中披露了一種通過補(bǔ)充含有化合物(如合成透明質(zhì)酸、從大豆獲得的磷脂或不飽和脂肪酸)操作介質(zhì)降低粘附性并增加粘度，同時保持所述介質(zhì)的流動性以幫助在植入前階段期間的顯微操作(包括將細(xì)胞顯微注射到胚胎中)，從而增加胚胎和細(xì)胞操作介質(zhì)的質(zhì)量和安全性的系統(tǒng)。
[0019]萊昂納多克里斯特曼(Leandro Christmann)在2005年9月12日提交的題為“用于顯微注射和再植入禽蛋的顯微注射組合件及其方法(Microinject1n Assemblyand Methods for Microinjecting and Reimplanting Avian Eggs)，，的美國專利申請?zhí)?1/224，364(或US2006/0010510A1)中披露了一種顯微注射組合件，其包括顯微鏡；包含顯微操作器、微量移液管和壓電振蕩器的顯微注射系統(tǒng)；及呈傾斜角度的大型監(jiān)測單元，所述組合件允許對禽蛋的胚盤進(jìn)行顯微注射。
[0020]丹尼爾G.奧康奈爾(Daniel G.0’ Connell)在2006年2月27日提交的題為“細(xì)胞盤(Cell Tray) ”的PCT專利申請?zhí)朠CT/US2006/0006868中披露了一種多孔細(xì)胞盤，其能夠自動處理并且同時監(jiān)測和分析大量的細(xì)胞、生物流體、化學(xué)試劑和/或固體樣品。
[0021]簡德索尼威爾(Jan De Sonneville)在2012年3月19日提交的題為“陣列式顯微注射設(shè)備及方法(Array microinject1n apparatuses and methods) ”的英國專利申請?zhí)?004629中披露了一種陣列式顯微注射設(shè)備，所述設(shè)備包括帶有一系列部分呈球形的凹口的表面。每個凹口可以容納單個細(xì)胞或單個胚胎。接著，可以使用與保持細(xì)胞或胚胎的凹口相配的一系列注射器將材料顯微注射到細(xì)胞或胚胎中，尤其是核中。
[0022]L.克里斯特曼(L.Christmann)在2008年3月4日申請專利的題為“顯微注射裝置及使用方法(Microinject1n Device and Method of Use) ” 的美國專利號 7，339，090中披露了包括針和觀測儀器的顯微注射裝置，其中所述觀測儀器使操作員能從除直角外的角度觀測放大的物體。
[0023]M.帕拉西奧-博伊斯(M.Palac1s-Boyce)在題為“可用于操作細(xì)胞或胚胎的微機(jī)電裝置(Microelectromechanical Devices Useful for Manipulating Cells orEmbyos) ”的WO 0065137-2000-11-02中提及包括一對復(fù)合物粘接的硅晶片的細(xì)胞標(biāo)記用微機(jī)電系統(tǒng)裝置。
[0024]M.帕拉賈普(M.Paranjape)等人在題為“使用娃單晶片顯微制造的陣列結(jié)合集成的微穿孔注射器進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Cell Transformat1n Using a Single ChipSilicon Microfabricated Array incorporating Micro-Piercing Injectors)，，的 WO2058847-2002-08-01中提供了用于將分子弓I入細(xì)胞中，從而在高通量水平上為所采取的這些程序提供高效手段的一種改進(jìn)的方法。
[0025]非專利文獻(xiàn)
[0026]1.seer, cancer, gov
[0027]2.巴里克 M(Balic Μ)，威廉姆 A (Williams A), # H (Lin H)，達(dá)塔 R(DatarR)，科特RJ.(Cote RJ.) (2012).循環(huán)腫瘤細(xì)胞:從實(shí)驗(yàn)室到病床(Circulating TumorCells:From Bench to Bedside),《醫(yī)學(xué)年評》(Annu Rev Med.)，2012 年 10 月 18 日[印刷版前電子版]
[0028]3.新倉直樹(Naoki Niikura)，劉軍(Jun Liu)，林直樹(Naoki Hayashi)，伊麗莎白八.米特多夫(Elizabeth A.Mittendorf),襲云(YunGong)，夏娜L.帕拉(Shana L.Palla)，德田豐(Yutaka Tokuda)，安娜Μ.閃薩雷斯-安古羅(AnaΜ.Gonzalez-Angulo)，力口布雷爾 N.霍托巴奇(Gabriel N.Hortobagyi)及直人 T.上野(Naoto T.Ueno) (2011).過表達(dá)人表皮生長因子受體2 (HER2)的原發(fā)乳房腫瘤的轉(zhuǎn)移部位中 HER2 表達(dá)的缺失(Loss of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)Express1n in Metastatic Sites of HER2-0verexpressing Primary Breast Tumors.)《臨床腫瘤學(xué)雜志》(J Clin Oncol)，30:593-599。
[0029]4.都彭特杰森 J(Dupont Jensen J),拉克霍姆 AV (Laenkholm AV)，克奴普A (Knoop A)，艾沃茲 M(Ewertz M)，班達(dá)魯 R(Bandaru R)，劉 W (Liu ff),哈克 W(Hackl ff),巴瑞特JC(Bauett JC),加德納H.(Gardner H.) (2011).PIK3CA突變可能在原發(fā)乳癌與其相應(yīng)轉(zhuǎn)移性疾病之間不一致(PIK3CA mutat1ns may be discordant between primaryandcorresponding metastatic disease in breast cancer.),〈〈臨床癌癥石開究〉〉(ClinCancer Res.) 17:667-770
[0030]5.克里斯托法力 M(Cristofanilli M)，布德 GT((Budd GT),艾利斯 MJ(EllisMJ)，斯托派克 A(Stopeck A)，馬特拉 J(Matera J)，米勒 MC (MiIIer MC)，魯本 JM (ReubenJM),多伊爾 GV(Doyle GV),艾拉德 WJ(Allard WJ),特斯塔彭 LW(Terstappen Lff),哈耶斯DF(Hayes DF).(2004).在轉(zhuǎn)移性乳癌中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、疾病發(fā)展及存活情況(Circulating tumor cells, disease progress1n, and survival in metastatic breastcancer.)，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(N Engl J Med.) 351:781-910
[0031]6.莫倫諾 JG(Moreno JG)，米勒 MC(Miller* MC)，格羅斯 S(Gross S)，艾拉德WJ (Allard WJ)，蓋米拉 LG(Gomella LG),特斯塔彭 LW(Terstappen LW).(2005).循環(huán)腫瘤細(xì)胞預(yù)測轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的存活率(Circulating tumor cells predict survivalin patients with metastatic prostate cancer.),《泌尿?qū)W》(Urology) 65:713_80
[0032]7.克漢 SJ(Cohen SJ)，龐特 CJ(Punt CJ)，伊安諾提 N(Iannotti N)，塞德曼BH(Saidman BH)，薩巴斯 KD (Sabbath KD)，力口布埃爾 NY (Gabrail NY),皮卡斯 J(Picus J)，莫斯 MA(Morse MA),米歇爾 E (Mitchell E)，米勒 MC(Miller MC),多伊爾 GV(Doyle GV),提辛格 H(Tissing H)，特斯塔彭 LW(Terstappen Lff),米羅普 NJ(Meropol NJ).(2009).轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的預(yù)后重要性(Prognostic significance ofcirculating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.)《月中瘤學(xué)年刊》(Ann Oncol.)20:1223-9ο
[0033]8.克雷布斯 MG(Krebs MG),索蘭 R(Sloane R)，普雷斯特 L(Priest L)，蘭卡夏L (Lancashire L),侯 JM(Hou JM),格蕾絲托克 A (Greystoke A),沃德 TH (Ward TH),法拉德奇 R (Ferraldeschi R),古月吉斯 A(Hughes A),科拉克 G(Clack G),拉森 M(Ranson Μ),戴S C(Dive C)，布拉克霍H1.(Blackhall FH.) (2011).非小細(xì)胞肺癌患者中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的評價和預(yù)后重要性(Evaluat1n and prognostic significance of circulating tumorcells in patients with non-small-cell lung cancer.)《臨床月中瘤學(xué)雜志》(J Cli