胎；
[0112]機(jī)械臂的位置和/或角度是手動或根據(jù)可商購的軟件控制接口，或通過開發(fā)的被專門設(shè)計用于在斑馬魚胚胎中進(jìn)行顯微注射的特定自動注射系統(tǒng)可調(diào)節(jié)的；
[0113]所述機(jī)械臂是通過胚胎結(jié)構(gòu)的人類視覺辨識，或通過借助于細(xì)胞的熒光標(biāo)記對胚胎結(jié)構(gòu)的視覺辨識，或借助于被編程成能夠檢測液體成功注射的軟件來控制的，所述軟件是可商購的軟件控制接口，或開發(fā)的專門設(shè)計用于在斑馬魚胚胎中進(jìn)行顯微注射的特定自動注射系統(tǒng)；
[0114]關(guān)于注射部位和注射方案的選擇的自動化是通過軟件更新改變的；及
[0115]自動顯微注射系統(tǒng)是通過可商購的顯微注射器注射系統(tǒng)，或通過所開發(fā)的專門設(shè)計用于在斑馬魚胚胎中進(jìn)行顯微注射的特定自動注射系統(tǒng)控制的。
[0116]本發(fā)明的有關(guān)測試藥物對腫瘤細(xì)胞的作用的方法方面的變化形式包括在向腫瘤細(xì)胞注射或不注射染色劑(例如親脂性熒光染色劑)之前，將腫瘤細(xì)胞顯微注射到受精后24到72小時的斑馬魚胚胎中，以及在將腫瘤細(xì)胞顯微注射到斑馬魚胚胎中之前、期間或之后，另外將促血管生成因子(例如生長因子血管生成素)顯微注射到受精后24到72小時的斑馬魚胚胎的胚胎中，或?qū)⒋傺苌梢蜃犹砑拥接凶恤~游動的水中。
[0117]本發(fā)明的其它特征
[0118]所述設(shè)備可以在存在適當(dāng)保持架和槽板并且不含可拆式插件的情況下使用，由此允許胚胎保持在槽板的凹槽中，同時可以通過微量移液管接近以在不同角度進(jìn)行顯微注射。在此配置中，可以將可拆式注射蓋板放到槽板上并且可以使用其來引導(dǎo)注射受精后48小時的斑馬魚胚胎，所述可拆式注射蓋板在由槽板形成的每個圓錐形孔之上具有內(nèi)襯橡膠的孔口。
[0119]本發(fā)明還提供了有關(guān)通過胚胎結(jié)構(gòu)的視覺辨識來控制機(jī)械臂的一種選擇。在這些情況下，軟件可以被設(shè)計成能夠在液體或標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)熒光時檢測成功注射。關(guān)于注射部位和注射方案的選擇的自動化也可以通過簡單的軟件更新改變。通過視覺辨識系統(tǒng)進(jìn)行自動化也能夠使用較小數(shù)量的胚胎和排空的孔。
[0120]本文中所描述的設(shè)備還可以與可商購的手動顯微注射器一起使用。即使用于手動操作，這一設(shè)備仍將通過減少額外的導(dǎo)管處理和標(biāo)記來減少勞動力。由于胚胎沒有從其孔中取出，故胚胎混合和誤標(biāo)記的幾率以及胚胎中的誘導(dǎo)應(yīng)力大幅減小。
[0121]當(dāng)在液體中存在活胚胎時，不能使用機(jī)械臂更換孔中的液體。然而，更換內(nèi)部不含活胚胎的一個孔中的介質(zhì)的能力使機(jī)械臂的使用可行。此外，手動更換含有活胚胎的孔中的液體會對胚胎產(chǎn)生極大應(yīng)力。通過這種方法，逐漸更換槽板外緣處呈圓柱形的孔模塊中的溶液可以降低對胚胎的不必要的應(yīng)力。
[0122]本發(fā)明不僅容易地處理用于顯微注射液體和細(xì)胞的大量胚胎，而且還能夠以一種高通量的方式進(jìn)行胚胎中腫瘤塊的適當(dāng)定位和注射。
[0123]本文中所描述的多顯微注射系統(tǒng)具有低成本，并且可以按“一次性使用”方式制造。
[0124]本文中所描述的多孔顯微注射系統(tǒng)和使用方法大大地簡化了大量胚胎的處理并且改進(jìn)了眾多實驗間的注射準(zhǔn)確性和一致性。由于單一模塊中的所有孔都是連接的，故所有胚胎都得到相同處理。由干燥引起的介質(zhì)體積的不等損失，或每個孔的添加量不等不會引起孔間的任何變化。同一處理組中的胚胎全部同等地暴露于此類改變。
[0125]這一多孔顯微注射系統(tǒng)的優(yōu)選實施例適于以96孔形式使用，不過這一系統(tǒng)也可以改為6孔板、12孔板或24孔板形式。
[0126]這一多孔顯微注射系統(tǒng)的優(yōu)選實施例適用于受精后48小時的斑馬魚胚胎，但也適于操作受精后24到72小時的斑馬魚胚胎、操作來自其它魚種(例如青鏘魚(Medaka))的胚胎以及來自非洲爪蟾屬、嚙齒動物、犬類及其它實驗動物的胚胎。
【附圖說明】
[0127]在附圖中:
[0128]圖1:侵襲性與非侵襲性原發(fā)性肺腫瘤細(xì)胞對藥物的差異性反應(yīng)。
[0129]圖1A:以圖形方式呈現(xiàn)通過成像采集的30個異種移植物的腫瘤坐標(biāo)。
[0130]圖1B:用太平洋紫杉醇(Paclitaxel)處理的28個異種移植物的腫瘤坐標(biāo)。
[0131]圖1C:用太平洋紫杉醇和卡鈾(Carboplatin)處理的29個異種移植物的腫瘤坐標(biāo)。(-D =無藥物對照，+P =用太平洋紫杉醇處理，C+P =用卡鉑和太平洋紫杉醇處理)
[0132]圖1D:計算的未處理的異種移植物和經(jīng)過處理的異種移植物的迀移指數(shù)。(-D =無藥物對照，+P =用太平洋紫杉醇處理，C+P =用卡鉑和太平洋紫杉醇處理)
[0133]圖1E:計算的未處理的異種移植物和經(jīng)過處理的異種移植物的侵襲指數(shù)。(-D =無藥物對照，+P =用太平洋紫杉醇處理，C+P =用卡鉑和太平洋紫杉醇處理)
[0134]圖1F:在異種移植物中觀察到腦轉(zhuǎn)移性腫瘤，簡要概述了在患者中所觀察到的器官歸巢現(xiàn)象。
[0135]圖1G:異種移植物中腦轉(zhuǎn)移性腫瘤的藥物反應(yīng)。(-D =無藥物對照，+P =用太平洋紫杉醇處理，C+P =用卡鉑和太平洋紫杉醇處理)
[0136]圖1H:用太平洋紫杉醇處理的異種移植物中侵襲性細(xì)胞和非侵襲性細(xì)胞的藥物反應(yīng)。藥物反應(yīng)是通過MGMT的表達(dá)測量，其中9種關(guān)于存活并且9種關(guān)于死亡。
[0137]圖11:用太平洋紫杉醇和卡鉑處理的異種移植物中侵襲性細(xì)胞和非侵襲性細(xì)胞的藥物反應(yīng)。
[0138]圖2是本發(fā)明一個方面的多孔板組裝部件的俯視圖；
[0139]圖3是圖2實施例的一個可拆式模塊的俯視圖；
[0140]圖4是顯示胚胎處理孔的截面，其中槽板位于圖2實施例的保持架內(nèi)；
[0141]圖5是圖2實施例的胚胎處理孔和可拆式插件的放大的截面；
[0142]圖6A是48hpf斑馬魚胚胎的水平截面圖，并且圖6B是48hpf斑馬魚胚胎的橫向截面圖；
[0143]圖7是在圖2實施例的存在注射蓋板和用于顯微注射的微量移液管的槽板中48hpf斑馬魚胚胎的布置的示意性側(cè)視圖；
[0144]圖8是圖2實施例的用于顯微注射的可旋轉(zhuǎn)微量移液管的示意性側(cè)視圖；
[0145]圖9是根據(jù)本發(fā)明的實施例，在槽板中的48hpf斑馬魚胚胎的示意性側(cè)視圖，所述槽板具有注射蓋板作為用于將腫瘤顯微注射到48hpf斑馬魚胚胎中的微量移液管的引導(dǎo)件；
[0146]圖10是根據(jù)本發(fā)明的實施例，在槽板中的48hpf斑馬魚胚胎的示意性側(cè)視圖，顯示了在胚胎處于槽板中時，用于顯微注射的微量移液管的可旋轉(zhuǎn)角度；及
[0147]圖1lA和圖1lB是根據(jù)本發(fā)明的實施例，在槽板中的48hpf斑馬魚胚胎的示意性側(cè)視圖，顯示了微量移液管旋轉(zhuǎn)的靈活性，同時仍允許接近槽板中用于進(jìn)行顯微注射的胚月臺O
【具體實施方式】
[0148]概述
[0149]癌細(xì)胞的分子和基因組特征分析已經(jīng)成為靶向療法和腫瘤學(xué)研究的新趨勢。然而，癌細(xì)胞的分子異質(zhì)性和其常常變化的動態(tài)性質(zhì)的關(guān)聯(lián)性、原發(fā)腫瘤以及侵襲或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞的分子標(biāo)簽的關(guān)聯(lián)性是有限的。在此情況下，由于當(dāng)前針對轉(zhuǎn)移性癌癥的化學(xué)療法的功效有限，以及癌細(xì)胞基因組特征分析的應(yīng)用有限，我們已探索在腫瘤組織外(例如，以手術(shù)方式取出的原發(fā)腫瘤、活檢體、CTC等)產(chǎn)生在生物學(xué)上相關(guān)的代表性存活3D腫瘤來獲得關(guān)于侵襲和轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)生理學(xué)信息的可能性。
[0150]對于一種成功的個體化靶向癌癥治療方法，需要一種能預(yù)測患者的腫瘤生理學(xué)(如生長、侵襲能力、轉(zhuǎn)移性器官歸巢等)以及對各種抗癌治療的反應(yīng)的快速分析方法。
[0151]然而，由于所有癌癥的動態(tài)性質(zhì)，使得個體化靶向治療方法變得復(fù)雜。由于每個原發(fā)性、侵襲性或轉(zhuǎn)移性腫瘤是由非均質(zhì)細(xì)胞群組成。因此，一種將癌細(xì)胞庫分離/分級分離成各種生理性或分子類別的方法是很重要的。
[0152]本發(fā)明提供了用于預(yù)測癌癥發(fā)展和對治療的反應(yīng)的分析和方法。所述方法可以使用一種高級的“癌癥發(fā)展和反應(yīng)基質(zhì)(Cancer Progress1n and Response Matrix)”。因此，本發(fā)明的某些實施例可以用于促進(jìn)基于可預(yù)測的腫瘤發(fā)展和對治療的反應(yīng)進(jìn)行個體化靶向療法的設(shè)計。
[0153]定義
[0154]如本文中所使用，除非詳細(xì)說明，否則以下術(shù)語具有以下含義:
[0155]“受試者”或“患者”或“個體”典型地包括人類，而且還可以包括其它動物，包括(但不限于)嚙齒動物、犬科動物、貓科動物、馬科動物、綿羊科動物、牛科動物、豬科動物及靈長類動物。
[0156]“腫瘤”包括在受試者體內(nèi)或身體上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞塊，其具有某種生理、組織學(xué)、分子和或構(gòu)造異常的形式。
[0157]“癌癥”包括具有以不受控制的方式生長的異常細(xì)胞的一類疾病的任何成員。這包括了所有贅生性病況和所有癌癥，無論其特征是良性、侵襲性、局部性、轉(zhuǎn)移前、轉(zhuǎn)移性、轉(zhuǎn)移后、軟組織還是實體性的，包括任何分期或等級。
[0158]“生物學(xué)”或“生理學(xué)”典型地包括形態(tài)、生理機(jī)能、解剖結(jié)構(gòu)、行為、起源及分布。
[0159]“病理生理學(xué)”完全典型地意謂與病況有關(guān)的無序的生理過程。確切地說，癌癥是由包括染色體異常、基因突變及表觀遺傳改變在內(nèi)的進(jìn)行性基因異常引發(fā)的一組疾病。特別是表觀遺傳改變，它是對不涉及核苷酸序列變化的基因組的功能相關(guān)的修飾，在調(diào)控癌細(xì)胞總體生物過程方面起到了重要作用。由于環(huán)境暴露，已經(jīng)觀察到表觀遺傳變化。
[0160]“活檢”是指取出細(xì)胞或組織樣品用于診斷或預(yù)后評價的方法。任何已知的活檢技術(shù)都可以應(yīng)用于本發(fā)明的方法和組合物。代表性活檢技術(shù)包括(但不限于)切除活檢、切取活檢、針穿刺活檢及手術(shù)活檢。所用活檢技術(shù)的選擇取決于有待評價的組織類型以及腫瘤的位置、大小和類型。
[0161]“侵襲”是指侵犯或侵入。確切地說，侵襲性腫瘤細(xì)胞是能夠侵入周圍組織中的細(xì)胞。并非所有腫瘤細(xì)胞都具有侵襲能力。
[0162]“轉(zhuǎn)移”是在距癌癥原發(fā)部位一定距離處發(fā)生的繼發(fā)惡性生長(“轉(zhuǎn)移性腫瘤”)。它是癌細(xì)胞從一個器官或身體的一部分?jǐn)U散到另一不相鄰的器官或部分。癌細(xì)胞首先移到循環(huán)系統(tǒng)(內(nèi)滲)中，隨后定位于繼發(fā)部位中，產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤(外滲)。
[0163]“循環(huán)腫瘤細(xì)胞”或“CTC”是已經(jīng)歷內(nèi)滲并且在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞。循環(huán)腫瘤外細(xì)胞包括(但不限于)循環(huán)腫瘤細(xì)胞、播散性癌細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞。循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以潛在地從如全血、痰液、支氣管灌洗液、尿液、乳頭抽吸液、淋巴、唾液、針抽吸液等任何可得到的生物流體獲得。
[0164]“器官歸巢”涉及循環(huán)腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移的器官中的種植。原發(fā)腫瘤傾向于轉(zhuǎn)移到特定的遠(yuǎn)端“目標(biāo)”器官。舉例來說，肺癌常常傾向于轉(zhuǎn)移到腦。所述過程或器官選擇不是一個隨機(jī)過程，不過器官歸巢背后的生理學(xué)尚未了解。
[0165]“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”是在細(xì)胞外信號傳導(dǎo)分子活化細(xì)胞表面受體(“信號傳導(dǎo)分子”或“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白”)時發(fā)生。此受體轉(zhuǎn)而改變細(xì)胞內(nèi)分子，產(chǎn)生反應(yīng)，所述反應(yīng)典型地包括一系列有序的生物化學(xué)反應(yīng)。
[0166]“分子遺傳腫瘤標(biāo)記物”或“MGTM”已經(jīng)基于腫瘤的生物特征，如腫瘤發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)行鑒別。一些實例包括(但不限于)致癌基因(K-ras、erbB-1 (EGFR)、erbB-2 (HER-2/neu)、bcl-2、c-myc/N-myc/L-myc、c_kit)、腫瘤抑制基因(p53、RB、pl6、p27、FHIT, RASSFl A)、端粒酶、侵襲和轉(zhuǎn)移標(biāo)記物(MMP、VEGF, C0X-2)、細(xì)胞粘附因子(E-鈣粘素、連環(huán)蛋白)、上皮標(biāo)記物(細(xì)胞角蛋白、CEA)、細(xì)胞凋亡標(biāo)記物(半胱天冬酶_3、裂解的PARP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以及抗癌藥敏感性標(biāo)記物(MRP、LRP、MDR、β -微管蛋白、ERCC1)。在抗癌藥存在下信號傳導(dǎo)路徑的差異性活化/去活化以及細(xì)胞侵襲性和/或器官歸巢的變化可以幫助選擇適于每位患者的適當(dāng)劑量的癌癥療法方案。可以存在眾多相關(guān)應(yīng)