用于卵巢癌的熒光定量pcr試劑盒及檢測(cè)方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于卵巢癌的巧光定量聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)（PCR)試劑盒及檢測(cè)方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 早期階段的卵巢癌具有較高的可治愈性，但大多數(shù)婦女在確診時(shí)已經(jīng)處于晚期， 因此，能存活5年的患者只占44%。卵巢癌早期缺乏特異性臨床指征，腫瘤細(xì)胞組織學(xué)分類 復(fù)雜，目前尚無(wú)有效的篩選試驗(yàn)?zāi)軌虼_診卵巢癌，早期檢測(cè)主要依靠卵巢惡性腫瘤及交界 性腫瘤的DNA定量分析作為診斷依據(jù)，方法有染色體分析、靜態(tài)細(xì)胞術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)，方法 復(fù)雜且靈敏度低；現(xiàn)有的卵巢癌標(biāo)志物肥4和CA125特異性也非常有限。因此，采用腫瘤特 異性mRNA來(lái)診斷卵巢癌具有明顯的優(yōu)勢(shì)，一個(gè)癌癥細(xì)胞可能有數(shù)百到數(shù)千拷貝的mRNA突 變區(qū)，相比DNA和腫瘤標(biāo)志物蛋白檢測(cè)更加靈敏可靠。
[0003]ETS最早是由美國(guó)化ederick國(guó)家癌癥研究所分子腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室在鳥骨髓成紅細(xì) 胞增多癥病毒E26的基因序列中發(fā)現(xiàn)的。ETV4作為ETS家族PEA3亞家族中的一員，也曾被 稱為腺病毒ElA增強(qiáng)子結(jié)合蛋白。FOXMl作為Fox轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其主要功能是 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞由Gl期到S期、G2期到M期的進(jìn)程來(lái)確保細(xì)胞有絲分裂增殖。正常水平的 FOXMl控制了細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞定期分裂時(shí)，F(xiàn)OXMl協(xié)調(diào)了遺傳物質(zhì)分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。 然而，當(dāng)FOXMl過(guò)表達(dá)時(shí)，該蛋白喪失了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的控制，讓細(xì)胞瘋狂生長(zhǎng)。FOXMl不僅可 W通過(guò)提高細(xì)胞增殖能力促進(jìn)早期腫瘤的形成，還可W在腫瘤晚期增強(qiáng)腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲 能力。LSR(脂解激活脂蛋白受體）的含量同樣表現(xiàn)出與腫瘤的相關(guān)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明需要解決的現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題是：現(xiàn)有的用于卵巢癌檢測(cè)的基于DNA分析的 試劑盒和裝置，操作復(fù)雜且靈敏度低，現(xiàn)有的基于卵巢癌標(biāo)志蛋白檢測(cè)的試劑盒和裝置，其 特異性和靈敏度有限。
[0005] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種用于卵巢癌的巧光定量PCR試劑盒，包括盒體1，其所述的盒體 1包括第一區(qū)域11、第二區(qū)域12和第=區(qū)域13,其中，所述的第一區(qū)域11包括標(biāo)準(zhǔn)品管4， 所述第二區(qū)域12包括引物管5,所述的第S區(qū)域13包括用于ETV4、F0XM1和/或LSR特異 性mRNA反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)液管2、巧光定量PCR反應(yīng)液管3和無(wú)核酸酶的水管6。
[0007] 優(yōu)選的，所述的標(biāo)準(zhǔn)品管4包括含ETV4的質(zhì)粒管，含F(xiàn)OXMl的質(zhì)粒管，W及含LSR 的質(zhì)粒管中的一種或幾種W上。
[000引優(yōu)選的，所述的引物管5包括ETV4特異性引物管，F(xiàn)OXMl特異性引物管，W及LSR特異性引物管中的一種或幾種W上。
[0009] 優(yōu)選的，所述的RT-PCR反應(yīng)液管2為包含有反轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶抑制劑、OligO(dT) 引物、dNTPs和緩沖液的反應(yīng)液管。
[0010] 優(yōu)選的，所述的巧光定量PCR反應(yīng)液管3為包含有巧光染料、DNA聚合酶、dNTPs和 緩沖液的反應(yīng)液管。
[0011] 具體而言，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0012] 本發(fā)明提供了一種用于卵巢癌的巧光定量PCR試劑盒，所述的試劑盒包括用于 ETV4、F0XM1和/或LSR特異性mRNA反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)液、巧光定量PCR反應(yīng)液、標(biāo) 準(zhǔn)品和引物序列。
[001引優(yōu)選的，所述的反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)液包括反轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶抑制劑、01igo(dT)引物、dNTPs和緩沖液。
[0014] 優(yōu)選的，所述的反轉(zhuǎn)錄酶的濃度為30~80U/y1，核酸酶抑制劑的濃度為3~8U/ y1，OligO(dT)引物的濃度為50~80yM，dNTPs的濃度為1~3mM，所述的緩沖液包括 200~SOOmM的S徑甲基氨基甲燒燈riS-肥1)、300~SOOmM的氯化鐘化Cl)、10~30mM的 氯化儀（MgCy和30~SOmM的二硫蘇糖醇值TT)。
[0015] 優(yōu)選的，所述的巧光定量PCR反應(yīng)液包括巧光染料、DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。
[0016] 優(yōu)選的，所述的DNA聚合酶的濃度為50~80U/ml，dNTPs的濃度為0. 4~ImM,所 述緩沖液包括80~120mM的S徑甲基氨基甲燒燈ris-HCl)，100~200mM的氯化鐘化Cl) 和8~15mM的氯化儀（MgCy。
[0017] 優(yōu)選的，所述的標(biāo)準(zhǔn)品包括含ETV4的質(zhì)粒，含F(xiàn)OXMl的質(zhì)粒，W及含LSR的質(zhì)粒中 的一種或幾種W上。
[001引優(yōu)選的，所述的引物序列包括用于ETV4特異性擴(kuò)增的引物序列，用于FOXMl特異 性擴(kuò)增的引物序列，W及用于LSR特異性擴(kuò)增的引物序列中的一種或幾種W上。
[001引優(yōu)選的，所述的用于ETV4特異性擴(kuò)增的引物序列包括引物1和引物2， 其中引物1的序列為：（5' -ggatacttggaccagcaagt-3')，引物2的序列為： (5,一邑actt邑at邑邑C邑attt邑t-3,）；
[0020] 用于FOXMl特異性擴(kuò)增的引物序列包括引物3和引物4,其中引物3的序列為： (5，-caaacagcggaacaaact-3，），引物 4 的序列為：（5，-tctgcttgattagactcct-3，）；
[0021] 用于LSR特異性擴(kuò)增的引物序列包括引物5和引物6,引物5的序列為： (5，-atatctgaaagcatgccct-3，），引物 6 的序列為：（5，-tggaagaggatcaccacgt-3，）。 [002引優(yōu)選的，所述的用于ETV4的引物1的濃度為：0. 5~1iiM，引物2的濃度為0. 5~ IyM;
[0023] 所述的用于FOXMl的引物3的濃度為0. 5~1yM，引物4的濃度為0. 5~1yM;
[0024] 所述的用于LSR的引物5的濃度為0. 5~1yM，引物6的濃度為0. 5~1yM。
[00巧]優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括無(wú)核酸酶的水。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種用于卵巢癌的巧光定量PCR試劑盒的檢測(cè)方法，包括如下步 驟：
[0027] (1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：分別取樣本mRNA，反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)液，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到樣本 cDNA；
[0028] (2)巧光定量PCR反應(yīng)：向反應(yīng)管中分別加入巧光定量PCR反應(yīng)液、模板cDNA、弓I 物序列，混合均勻后通過(guò)巧光定量PCR反應(yīng)得到ETV4、FOXMl和/或LSR;
[0029] 其中，所述模板CDNA包括：步驟（1)制備的樣本cDNA、含待測(cè)基因ETV4、F0XM1和 /或LSR的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0030] 優(yōu)選的，所述的步驟（1)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為37或42°C解育20~30min;然 后置于94~95°C條件下，反應(yīng)5~lOmin。
[003。 優(yōu)選的，所述的步驟似的巧光定量PCR的擴(kuò)增條件設(shè)置為94~95°C預(yù)變性2~ 5min，1個(gè)循環(huán)；94~95°C15~20s、55~60°C40~60s，40~50個(gè)循環(huán)；最后60~ 95°C1~2min，1個(gè)循環(huán)。
[0032] 優(yōu)選的，所述的樣本包括取自于被測(cè)個(gè)體的子宮頸。
[0033] 本發(fā)明還提供了上述所述的試劑盒W及所述的檢測(cè)方法在檢測(cè)與卵巢癌相關(guān)的 基因特異性HiRNA水平中的應(yīng)用。
[0034]ETV4是ETS家族多瘤病毒增強(qiáng)子激活劑（PEA) 3亞家族的一員，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和 功能，通過(guò)對(duì)ETV4轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的分析，發(fā)現(xiàn)它在人類胚胎期和成年期的多種器官的 正常組織中都有低水平的表達(dá)。在正常組織和癌組織的對(duì)比研究中，通過(guò)檢測(cè)ETV4的mRNA 水平發(fā)現(xiàn)兩者之間有明顯差異。ETV4與正常細(xì)胞分裂有關(guān)，但是在與其它基因融合時(shí)，則出 現(xiàn)過(guò)度表達(dá)的異?；钚?，它的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移 性。
[0035] FOXMl是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的一種亞型，其表達(dá)及轉(zhuǎn)錄激活需要多因子、多細(xì)胞信 號(hào)通路的共同參與，并依賴于細(xì)胞周期進(jìn)程。FOXMl的表達(dá)水平與正常細(xì)胞的增值、衰老及 器官的形成過(guò)程密切相關(guān)，而其異常表達(dá)則通過(guò)影響基因組的穩(wěn)定性及有絲分裂過(guò)程的進(jìn) 展等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，且FOXMl在腫瘤干細(xì)胞的存在即維持干細(xì)胞多能性方面 發(fā)揮重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)人類大多數(shù)腫瘤中的FOXMl都具有較高的表達(dá)水平，與多種致 瘤信號(hào)途徑相關(guān)。
[0036] 加州大學(xué)圣地亞哥醫(yī)學(xué)院W及Moores癌癥中屯、科學(xué)家通過(guò)特定的生物信息學(xué)算 法，分析兩個(gè)公共遺傳信息數(shù)據(jù)庫(kù)一一癌癥基因圖譜（TCGA)和基因組織表達(dá)程序（GTEx) 鑒定出卵巢癌細(xì)胞中含有LSRmRNA,證明其在卵巢癌組織中特異性表達(dá)。
[0037] 本發(fā)明基于卵巢癌的特異性mRNA進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)研究，創(chuàng)造性的選取了與卵巢癌 相關(guān)性強(qiáng)的ETV4、FOXMl和/或LSR基因進(jìn)行檢測(cè)，有效的用于卵巢癌的特異性檢測(cè)，表現(xiàn) 出強(qiáng)的特異性和高的靈敏度。
[0038] 本發(fā)明的試劑盒應(yīng)保存于-20°C及W下，盡量減少反復(fù)凍融。
[0039] 本發(fā)明的有益效果是：
[0040] (1)采用腫瘤特異性mRNA檢測(cè)對(duì)早期卵巢癌進(jìn)行診斷，比DNA和腫瘤標(biāo)志物蛋白 檢測(cè)更加靈敏，可用于卵巢癌的早期篩查及治療監(jiān)測(cè)；同時(shí)對(duì)設(shè)及卵巢癌的ETV4、F0XM1、 LSR=者進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，靈敏度和特異性更高。
[00川 似通過(guò)實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)對(duì)卵巢癌特異性mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便快 速。
[0042] (3)樣本易采集，只需通過(guò)常規(guī)的己氏試驗(yàn)在子宮頸收集從卵巢擴(kuò)散出的卵巢癌 特異性mRNA。
[0043] 下面結(jié)合附圖和各個(gè)【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
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