水樣中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測(cè)質(zhì)控試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種水樣中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測(cè)質(zhì)控試劑盒和檢測(cè)方法，屬 于食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食源性病毒檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 甲型肝炎病毒、諾如病毒等病毒是多起重大的水源性非細(xì)菌性疾病的流行病學(xué)事 件暴發(fā)的元兇。其中，甲型肝炎病毒化巧atitisAVirus,HAV)是一種正鏈RNA病毒，它屬 于小RNA病毒科肝病毒屬。雖然現(xiàn)在已成功地研制出甲肝疫苗，有效地控制了甲肝的傳播 和流行，但在人群免疫水平低的地方，人群普遍易感，HAV主要通過(guò)糞-口途徑污染水或食 物，導(dǎo)致甲肝暴發(fā)流行。HAV基因組雖然只有一個(gè)血清型，但有7基因型，在同一地區(qū)可能存 在多種HAV基因型的流行。
[0003] 諾如病毒是杯狀病毒科呈二十面體對(duì)稱球形單股正鏈RNA病毒，又稱為諾羅 病毒、諾沃克病毒或脈融病毒，是一種引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病毒，W腸道傳 播為主，可通過(guò)污染的水源、食物、物品、空氣等傳播。諾如病毒基因組全長(zhǎng)約7. 7化，包 含3個(gè)開放閱讀框（ORFs)，ORFl編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA聚合酶（RNA-cbpendentRNA 口〇171116拘36，1?(1化）；01^^2和01^^3分別編碼主要（￥口1)和次要（￥口2)衣殼蛋白；根據(jù)￥口1序 列的同源性，諾如病毒可分為GI~GV五個(gè)基因群（Genogroup),其中引起人類感染的主要 是GI和GII群
[0004] 在我國(guó)及世界上大多數(shù)國(guó)家，對(duì)于水質(zhì)中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測(cè)缺乏標(biāo)準(zhǔn) 質(zhì)量控制體系，原因主要在于缺乏有效，簡(jiǎn)單、快速、可靠的技術(shù)用于濃縮和檢測(cè)運(yùn)些病原。 實(shí)時(shí)巧光RT-PCR等分子檢測(cè)方法由于其高度靈敏、特異的特點(diǎn)，是目前用于檢測(cè)環(huán)境樣本 中病毒的最有效方法，但由于水環(huán)境中存在的致病病毒量極低，能否將大量水體中極其微 量但卻足W使人致病的病毒粒子有效的濃縮，成為將運(yùn)些分子方法成功應(yīng)用的關(guān)鍵點(diǎn)。現(xiàn) 行的檢測(cè)方法中，缺乏對(duì)整個(gè)的檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行良好質(zhì)量控制的步驟和方法，本發(fā)明利用大 腸桿菌隧菌體MS2與甲型肝炎病毒和諾如病毒在形態(tài)、大小、對(duì)環(huán)境的耐受力與病毒粒子 相似W及對(duì)人體無(wú)危害等特性，構(gòu)建了水樣中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測(cè)質(zhì)控試劑盒和 檢測(cè)方法，準(zhǔn)確監(jiān)控病毒顆粒裂解效率和核酸提取等整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系， 對(duì)環(huán)境水樣和食源性病毒的監(jiān)測(cè)具有重要意義，彌補(bǔ)了現(xiàn)行檢測(cè)方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水樣中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測(cè)質(zhì) 控試劑盒和檢測(cè)方法，可W對(duì)檢測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行甲型肝炎病毒和諾如病毒的檢測(cè)，并能夠 監(jiān)控整個(gè)檢測(cè)過(guò)程并保證檢測(cè)結(jié)果的有效性。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供的水樣中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測(cè)質(zhì)控試劑盒包括HAV 2XRT-PCRmix、NVGI+GII分型 2XRT-PCRmix、MS22XRT-PCRmix、無(wú)RNase水、HAV陽(yáng) 性對(duì)照、NVGI+GII陽(yáng)性對(duì)照、大腸桿菌隧菌體MS2 (2.5Xl〇i°p化/mL)各一管。
[0008]HAV2XRT-PCRmix、NVGI+GII分型 2XRT-PCRmix、大腸桿菌隧菌體MS2 2XRT-PCRmix中設(shè)及的檢測(cè)引物和探針如下：
[0009] (1)甲型肝炎病毒檢測(cè)引物和探針：
[0010]正向引物HAV-F:5' -TCACCGCCGTTYGCCTAG-3'
[0011]反向引物HAV-R: 5 ' -GGGGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3,
[0012] 探針HAV-P: 5 ' -FAM-CCTGAACYYGCAGGAATYAA-MGB-B冊(cè)-3,
[001引似
[0014] 諾如病毒檢測(cè)引物和探針
[0015] 諾如病毒G I:
[0016]正向引物NVGl-F:5' -CGYTGGATGCGNTTYCAT-3，
[0017] 反向引物NVGl-R:5' -CCTTAGACGCCATCATCATTYAC-3，
[0018]探針NVGl-P:5，-切5-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-B冊(cè)-3，
[001引做
[0020] 諾如病毒檢測(cè)引物和探針
[0021] 諾如病毒GII:
[0022] 正向引物NVG2-F: 5，-ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3 '
[0023]反向引物NVG2-R: 5，-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3 '
[0024]探針NVG2-P: 5 ' -FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-B冊(cè)-3，
[00 巧] (4)
[0026] 大腸桿菌隧菌體MS2檢測(cè)引物和探針
[0027]MS2-TM3-F:5' -GGCTGCTCGCGGATACCC-3
[0028]MS2-TM3-R： 5 ^ -TGAGGGAATGTGGGAACCG-3
[0029]MS2-TM2JW:5'-WE-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-NFQ-3'。
[0030]除了引物，HAV2XRT-PCRmix、NVGI+GII分型 2XRT-PCRmix、大腸桿菌隧 菌體MS2 2XRT-PCRmix中其他的試劑，例如酶、dNTP等均為現(xiàn)有的公知試劑。
[0031] 本發(fā)明還提供一種利用本發(fā)明的試劑盒來(lái)檢測(cè)水樣中甲型肝炎病毒和諾如病毒 的方法，包括W下步驟：
[0032] ①濃縮病毒（正電荷濾膜法）
[0033] 在待檢水體中加入100yL過(guò)程控制病毒大腸桿菌隧菌體MS2,調(diào)節(jié)待檢水體抑值 至7. 0,在無(wú)菌條件下，過(guò)濾全部樣品通過(guò)直徑47mm、孔徑0. 45ym的正電荷濾膜；轉(zhuǎn)移濾膜 至50mL無(wú)菌A離屯、管中，加入4mLTG邸緩沖液；另外IOmLTG邸緩沖液加入水樣瓶子中， 離屯、管和瓶子500oscillations/min振蕩20±5min;收集試管和瓶子里的洗出液至B離屯、 管中；用另外2mLTG邸緩沖液沖洗放濾膜的離屯、管內(nèi)壁，輕輕搖晃和顛倒振蕩，加入到A離 屯、管里。
[0034] 用0.Imol/L的肥1調(diào)整到抑7. 0 + 0. 5,并轉(zhuǎn)移至離屯、過(guò)濾濃縮器。4000Xg離屯、 15min，轉(zhuǎn)移濃縮液至干凈的1. 5血離屯、管中。
[003引 用PBS調(diào)整體積至500yL，W備提取RNA。
[003引②病毒RNA提取
[0037] ③大腸桿菌隧菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[003引取制備好的大腸桿菌隧菌體MS2質(zhì)控樣品，稀釋至2.5X10l°p化/mレ取100iiL進(jìn) 行提取病毒RNA，最終稀釋于100yL無(wú)RNA酶&0中；取20yL稀釋于180yL無(wú)RNA酶 &0,梯度稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，則病毒濃度分別代表2. 5X109、 2. 5Xl0s、2. 5X10\2. 5X106、2. 5X105、2. 5Xl04pfu/mL，分別進(jìn)行巧光定量RT-PCR反應(yīng)， 應(yīng)用Ct值和隧菌體濃度建立回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039] ④甲型肝炎病毒、諾如病毒GI型和GII型、大腸桿菌隧菌體MS2檢測(cè)
[0040] 將步驟②提取的RNA分別取5yL分別對(duì)甲型肝炎病毒、諾如病毒GI型和GII 型、大腸桿菌隧菌體MS2S種目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)目標(biāo)反應(yīng)體系包括：2XRT-PCRmix 12. 5yL樣品5y^水補(bǔ)齊至25y以每個(gè)樣品做原倍提取液和IOX稀釋提取液，同時(shí)設(shè)置 陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0041] ⑥病毒RNA回收率確定
[004引根據(jù)MS2巧光定量RT-PCR反應(yīng)獲得的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算出MS2濃 度，除W加樣時(shí)的病毒濃度，乘W100%即為回收率，即：回收率（％) =(回收后病毒濃度 /加注病毒濃度）X100。
[0043] ⑧結(jié)果判定原則
[0044] 檢測(cè)結(jié)果判定必須在陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照成立的情況下做如下判定：
[0045] 根據(jù)MS2的回收效率判定結(jié)果的有效性；若病毒RNA回收率大于或等于1 %測(cè)試 有效，根據(jù)檢測(cè)情況判定甲型肝炎病毒和諾如病毒結(jié)果；若病毒RNA回收率小于1%，則需 要重新進(jìn)行檢測(cè)。
[0046] 本發(fā)明所述的大腸桿菌隧菌體MS2及其大腸桿菌隧菌體MS2質(zhì)控樣品依據(jù)發(fā)明專 利號(hào)是2015102273402,發(fā)明名稱是《大腸桿菌隧菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法》的公開 的技術(shù)內(nèi)容制備。
[0047] 本發(fā)明的有益效果：
[0048] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了大腸桿菌隧菌體MS2與甲型肝炎病毒和諾如病毒GI和GII的 RT-PCR檢測(cè)引物。
[0049] 利用大腸桿菌隧菌體MS2與甲型肝炎病毒和諾如病毒在形態(tài)、大小、對(duì)環(huán)境的耐 受力與病毒粒子相似W及對(duì)人體無(wú)危害等特性，構(gòu)建了水樣中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢 測(cè)質(zhì)控試劑盒和檢測(cè)方法，即通過(guò)特定濃度的大腸桿菌隧菌體MS2監(jiān)控整個(gè)處理和