一種固相化細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種固相化的細(xì)胞，及在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 固相化細(xì)胞技術(shù)（ImmobilizedCells)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一口新興 技術(shù)，在化工、能源、環(huán)保和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，它是指利用各種理化方法將游離 細(xì)胞定位于特定的空間區(qū)域內(nèi)，提高細(xì)胞或酶的濃度，并保持生物活性和反復(fù)利用的技術(shù)。 與傳統(tǒng)的懸浮生物處理法相比，固相化細(xì)胞有提高單位體積的細(xì)菌密度、菌體易回收、環(huán)境 耐受力增強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且將菌體固相化可增加底物或產(chǎn)品對(duì)細(xì)胞膜的滲透性和酶的熱穩(wěn)定 性。固相化細(xì)胞保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)和天然環(huán)境，有效地利用游離細(xì)胞的完整酶系 和細(xì)胞膜的選擇通透性，其優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于：1.不需要將酶從微生物細(xì)胞中提取出來(lái)并加W純 化，酶活力損失小，成本低；2.酶處于天然細(xì)胞環(huán)境中中穩(wěn)定性高；3.細(xì)胞生長(zhǎng)停滯期時(shí)間 短，細(xì)胞多，反應(yīng)快，抗污染能力強(qiáng)，可W連續(xù)發(fā)酵，反復(fù)使用，應(yīng)用成本低。
[0003] 目前的細(xì)胞固相化技術(shù)最多采用的方法中，W海藻酸鋼、角叉菜聚糖等為載體，水 溶解后通過(guò)和待固相化的細(xì)胞種子液混合，在含巧的溶液中形成凝膠，從而將細(xì)胞包埋或 者結(jié)合其中，形成包含有細(xì)胞的固相化顆粒。能夠形成凝膠的材料分子還包括聚乙締醇。
[0004] 海藻酸鋼是從褐藻中提取的多糖，主要成分是Beta-D甘露糖醒酸和A1地aA-古 洛糖醒酸構(gòu)成的多糖。k古洛糖只在海洋植物中存在，動(dòng)物體內(nèi)不存在k古洛糖及其衍 生物，因此采用海藻酸鋼包埋的細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)生物相容性差，會(huì)引起免疫反應(yīng)。而且海 藻酸可W吸附銅、鋒和儘等二價(jià)金屬離子，運(yùn)些金屬離子是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要添加 的微量元素，對(duì)于維持細(xì)胞的正常代謝和提高重組蛋白的表達(dá)水平有重要的作用。角叉菜 聚糖是從鹿角菜等海洋植物中提取的聚糖，又名卡拉膠。角叉菜聚糖需要在較高的溫度下 (80°C)才能溶于水，低溫下容易沉淀，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般不能耐受高溫。聚乙二醇也可 W用于細(xì)胞的包埋，但是易引起細(xì)胞脫水，在機(jī)體內(nèi)有一定的毒性。
[0005] 果膠是食品的天然成分之一，天然果膠類物質(zhì)W原果膠、果膠、果膠酸的形態(tài)廣泛 存在于植物的果實(shí)、根、莖、葉中，是細(xì)胞壁的一種組成成分，它們伴隨纖維素而存在，構(gòu)成 相鄰細(xì)胞中間層粘結(jié)物，使植物組織細(xì)胞緊緊黏結(jié)在一起。原果膠是不溶于水的物質(zhì)，但可 在酸、堿、鹽等化學(xué)試劑及酶的作用下，加水分解轉(zhuǎn)變成水溶性果膠。果膠本質(zhì)上是一種線 形的多糖聚合物，含有數(shù)百至約1000個(gè)脫水半乳糖醒酸殘基，其相應(yīng)的平均相對(duì)分子質(zhì)量 為50000~150000。半乳糖及其衍生物是動(dòng)物體內(nèi)常見(jiàn)的糖分子，因此果膠在動(dòng)物體內(nèi)有 較好的生物相容性，安全性高，不會(huì)引起免疫反應(yīng)。在細(xì)胞培養(yǎng)工程中也不會(huì)吸附微量元素 及其它的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)于維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞的正常代謝和高的重組蛋白表達(dá)水平具有重要 的意義。
[0006] 殼聚糖（化itosan)又稱脫乙酷甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾下質(zhì)（化itin) 經(jīng)過(guò)脫乙酷作用得到的，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺（1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。自1859年， 法國(guó)人Rouget首先得到殼聚糖后，運(yùn)種天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、 安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、生化 和生物醫(yī)學(xué)工程等諸多領(lǐng)域的有了廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，果膠和殼聚糖是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和 世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的食品添加劑，沒(méi)有添加限制。
[0007] 由于果膠可W被人結(jié)腸中菌群分泌的果膠酶所降解，因此W果膠作為陰離子組 分、殼聚糖和巧離子作為陽(yáng)離子組分，采用液中固相法制備骨架型微丸來(lái)制備藥物結(jié)腸定 位釋放制劑已經(jīng)有廣泛報(bào)道，但是沒(méi)有報(bào)道用于活細(xì)胞的固相化。鑒于現(xiàn)有技術(shù)在細(xì)胞固 相化存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明意欲提供一種使用果膠對(duì)工程細(xì)胞進(jìn)行固相化的方法， 從而有利于工程細(xì)胞的產(chǎn)物生成和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一種固相化細(xì)胞的制備方法，所述方法包 括W下步驟：
[000引 （1)在含欲被固相化細(xì)胞的懸液中加入果膠溶液，加入后的細(xì)胞懸液中，細(xì)胞濃度 為l04-l0Vml;果膠濃度為1-10%;
[0010] (2)在步驟（1)獲得的細(xì)胞懸液中加入含有氯化巧和殼聚糖的溶液，攬拌5-15分 鐘，其中氯化巧的濃度為0.5-10%，殼聚糖的濃度為0. 1-5% ;
[0011] 做過(guò)濾步驟似獲得的溶液，并重新懸浮獲得的細(xì)胞。
[0012] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟（1)中細(xì)胞濃度為5Xl〇5/ml，果膠濃度為 5%。
[0013] 在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟（2)中氯化巧的濃度為3%，殼聚糖的濃度 為 0. 5%。
[0014] 在一個(gè)更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述細(xì)胞為可W表達(dá)并分泌抗人化r-2抗原人源 化單克隆抗體的工程細(xì)胞CH0。
[0015] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述固相化細(xì)胞的制備方法表達(dá)并分泌抗人 Her-2抗原的人源化單克隆抗體的方法。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述方法包括：
[0017] (1)將上述步驟（3)制備好的CH0細(xì)胞微球懸浮于CD-Forti-CHO無(wú)血清培養(yǎng)基 中，振蕩培養(yǎng)3-5天；
[0018] (2)回收培養(yǎng)基中的雙特異性人源化單克隆抗體。
[0019] 在一個(gè)更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述細(xì)胞微球與所述培養(yǎng)基的體積比為1 :2，
[0020] 在一個(gè)最為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境為37°C，5%的0)2,及15化pm 振蕩培養(yǎng)。
[0021] 第=方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)上述固相化細(xì)胞的制備方法獲得的細(xì)胞在制備乳 腺癌治療藥物中的應(yīng)用。
[0022] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述細(xì)胞被制備為皮膚植入劑。
[0023] 發(fā)明人設(shè)計(jì)了采用果膠、殼聚糖和巧離子液相固化微丸的方法對(duì)工程細(xì)胞進(jìn)行固 相化，從而可W保持細(xì)胞的活性。而果膠巧形成的骨架允許細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)入微丸，維持 細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分裂，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物可W分泌出微丸，進(jìn)而從培養(yǎng)基中分離純化相關(guān) 的重組蛋白；采用果膠巧包埋的能夠表達(dá)并分泌雙特異性人源化單克隆抗體的CK)工程細(xì) 胞，可w連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行抗體的生產(chǎn)；包埋后的細(xì)胞抗體分泌量在第一次培養(yǎng)階段，抗體的表 達(dá)量略低于常規(guī)培養(yǎng)的CK)細(xì)胞，在第二和第=批次3-5天的抗體表達(dá)量，可W達(dá)到常規(guī)培 養(yǎng)14天的表達(dá)量?？贵w的生產(chǎn)時(shí)間可W縮短到3-5天，與常規(guī)的培養(yǎng)20-30天的時(shí)間相 比，大大提高了生產(chǎn)效率；而且，細(xì)胞微球的培養(yǎng)基中CK)細(xì)胞殘留蛋白的濃度顯著低于正 常培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，第一批次HCP的濃度為37. 5yg/ml，第二批次的HCP濃度為43. 4yg/ ml,第S批次的HCP濃度為52. 7yg/ml，而常規(guī)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中HCP的濃度達(dá)到 162. 6yg/ml，說(shuō)明包埋后細(xì)胞的存活率較高，HCP的濃度較低，在后續(xù)的抗體純化中，可W 顯著降低HCP的殘留。而死亡細(xì)胞的DNA與果膠巧結(jié)合，不全部釋放到培養(yǎng)基中，測(cè)定的 CH0DNA濃度只有常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞的1/10,因此可W顯著提高后續(xù)純化過(guò)程抗體的純度，降低 雜質(zhì)的含量。
[0024] 固相化的細(xì)胞可W作為植入劑植入病人皮下，分泌的治療性蛋白，如抗體類藥物、 EP0等可W直接進(jìn)入人體，起到治療疾病的作用。在一定時(shí)間，可W將微丸通過(guò)手術(shù)的方法 取出并放置新的微丸，避免了長(zhǎng)期注射的問(wèn)題。而且，果膠巧微丸具有良好的生物相容性， 未在移植部位產(chǎn)生明顯的排斥反應(yīng)，穩(wěn)定性也較好，17天未見(jiàn)微丸明顯的降解和破壞，因此 運(yùn)一方法也可W用于疾病的治療。
【附圖說(shuō)明】
[00巧]圖1.常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞與被包埋后的細(xì)胞分泌抗體濃度的柱狀圖；
[0026] 圖2.培養(yǎng)基中CH0細(xì)胞蛋白殘留濃度的柱狀圖；
[0027] 圖3.被包埋細(xì)胞微丸的小鼠觀察圖；
[002引圖4.被包埋小鼠血清中雙特異性抗體的濃度隨時(shí)間變化的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但運(yùn)些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。
[0030] 實(shí)施例1.固相化細(xì)胞微丸的制備
[0031] 細(xì)胞的培養(yǎng)：可W表達(dá)抗人化r-2抗原的人源化單克隆抗體化rc巧tin的 C冊(cè)細(xì)胞（構(gòu)建方法見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)CN201510368641. 7)接種于CD-Forti-C冊(cè)培養(yǎng)基 (Invitrogen，貨號(hào)：A11483-〇l)，37°C，5%C〇2,ISO巧m振蕩培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到 5X1〇6/ ml, 100化pm室溫離屯、5分鐘，棄上清，用新鮮的培養(yǎng)基垂懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度到lOVml， 備用。
[0032] 氯化巧交聯(lián)溶液的配制：氯化巧3 % (g/v，濃度范圍：0. 5-10 % )，0. 5 % (0. 1-5% )殼聚糖，溶解于80mlCD-Forti-C冊(cè)培養(yǎng)基中，采用1%的憐酸調(diào)節(jié)抑值到 5. 5 (2. 5-7. 0)，至溶液完全變清，補(bǔ)充體積到100ml，0. 22um濾器過(guò)濾除菌。
[0033] 果膠巧微丸的制備步驟：
[0034] (1)含果膠細(xì)胞懸液的配制：
[00對(duì) 果膠5g溶解于90mlCD-Forti-C冊(cè)培養(yǎng)基（Invitrogen)，4°C攬拌過(guò)夜，0. 22um 過(guò)濾除菌，溫度恢復(fù)到室溫后，加5ml細(xì)胞懸液，補(bǔ)充體積到100ml，此時(shí)細(xì)胞密度5X10^ ml(范圍：l04-l0Vml)，果膠濃度為5%(濃度范圍：0. 5-10%)。
[003引似交聯(lián)
[0037] 在生物安全柜中采用注射器巧血，7#針頭）將果膠細(xì)胞懸液邊緩慢攬拌邊滴加 到抑5. 5氯化巧交聯(lián)溶液中，針頭離液面高度約為5cm左右，用磁力攬拌器攬拌，滴速大約 2血/min,交聯(lián)時(shí)間lOmin。交聯(lián)完成后，篩網(wǎng)過(guò)濾，PBS清洗S次，重懸于CD-Forti-C冊(cè)培 養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[003引所制備的微丸均為圓球形，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行目測(cè)法測(cè)定微丸的直徑。具體操作 為：取少許濕微丸，加蒸饋水分散，蓋上蓋玻片（注意除盡氣泡），用有刻度標(biāo)尺（刻度已校 正其每格的ym數(shù)）的接目鏡的顯微鏡，測(cè)量100個(gè)微囊，微丸粒徑分布在0.8-1. 1mm間， 微丸外膜的厚度大約為0. 05-0. 07mm。
[0039] 實(shí)施例2.固相化細(xì)胞的流