用于鑒別西洋參的多重pcr特異引物對(duì)及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥材鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及基于多重PCR鑒別西洋參的引物對(duì)及 其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 西洋參PanaxquinquefoliumL.為五加科植物Araliaceae人參屬Panax西洋參 的干燥根，又名花旗參，原產(chǎn)加拿大蒙特利爾、加拿大安大略省和美國康斯威星州，我國市 場(chǎng)上的西洋參主要有兩種：一種是進(jìn)口，一種是引進(jìn)種植。我國從20世紀(jì)70年代開始引 進(jìn)種植，隨著長期引進(jìn)栽培種植及生產(chǎn)實(shí)踐的篩選，形成中國西洋參的=大主產(chǎn)種植區(qū)：東 北、北京和山東。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：國產(chǎn)西洋參與進(jìn)口西洋參的皂巧總含量、分組皂巧成 分種類與含量均基本相同，國產(chǎn)西洋參于1988年被定為新藥，明確規(guī)定國產(chǎn)西洋參與進(jìn)口 西洋參同等入藥。五加科人參屬Panax主要藥用植物為：人參PanaxginsengC.A.Mey.、 西洋參PanaxquinquefoliumL.和S屯Panaxnotoginseng(Burkill)F.H.Chenex C.化ow&W.G.化ang;人參主要產(chǎn)于我國東北S省和朝鮮，S屯主產(chǎn)于云南、廣西。S者都是 我國常用的珍貴藥材，但其價(jià)格差異很大；人參、=屯自1963年起歷版《中國藥典》均有收 載，西洋參自《中國藥典2000年版一部》起有收載W。上述=者由于來源于同科同屬不同 種植物的相同部位，因而其內(nèi)部組織構(gòu)造、所含化學(xué)成分均有很大相似之處，給實(shí)際工作中 的鑒定增加了難度，對(duì)于鑒別單味及成方制劑，難度就更大。所W，市場(chǎng)上經(jīng)常出現(xiàn)用其它 根類藥材，如人參充作西洋參；但人參和西洋參藥性和功效差異較大，人參具補(bǔ)氣、固脫、生 津、益智、安神的功效；西洋參具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，益胃生津、清熱除煩之功效；但二者的形態(tài)、 性狀十分相似，特別是國內(nèi)栽培西洋參和栽培人參很難根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行準(zhǔn)確鑒 另IJ，兩者的飲片和粉末更是難W區(qū)別。市場(chǎng)存在相互混用的情況，由于=者藥性和藥效有很 大區(qū)別，而傳統(tǒng)的分析鑒別方法，是根據(jù)形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)成分上鑒別，而運(yùn)些傳 統(tǒng)的鑒別方法干擾因素較多，易受環(huán)境和植物本身的影響和限制；故要求采用先進(jìn)的鑒定 技術(shù)進(jìn)行區(qū)分，從而保證患者的用藥安全。因此，市場(chǎng)需求一種不依賴于其形態(tài)特征的鑒別 西洋參的方法。
[0003] 隨著科學(xué)的不斷前步，應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒定中藥材及其飲片，取得了快速 地發(fā)展，在中藥材真?zhèn)舞b別中發(fā)揮了重要的輔助鑒定作用，具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定、 成本低等優(yōu)點(diǎn)；不受樣品形態(tài)的限制，可應(yīng)用于原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中 成藥（丸劑、散劑等）；所需檢樣量小，對(duì)珍稀貴重類藥材及化石標(biāo)本的鑒定更具應(yīng)用價(jià)值； 將先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)研究結(jié)合起來，是中藥研究現(xiàn)代化的重要手段，現(xiàn)行《中 國藥典》2010年版一部采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，作為烏梢蛇、薪蛇炮制品的質(zhì)量評(píng)定方法， 標(biāo)志著分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)作為法定的中藥鑒定方法之一，擴(kuò)充了中藥鑒定的科學(xué)內(nèi)涵。 目前，尚未有任何公開或報(bào)道過采用特異性多重PCR的方法實(shí)現(xiàn)西洋參的快速、準(zhǔn)確鑒別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于多重PCR鑒別西洋參的引物及方 法。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0006] 所述多重PCR引物對(duì)包括引物對(duì)1和引物對(duì)2 :
[0007] 所述引物對(duì)1的序列為：
[0008]UP:5' -GTTTTTTMAAAGAAAAGATAAAAATG-3'（沈Q IDNO. 1);
[0009]LO:5'-CCCTACTATTCTTTTCCTTACGTT-3'（沈Q IDNO. 2)。
[0010] 所述引物對(duì)2的序列為：
[0011]UP:5,-CGCCCTTCTCATAAGATGTTG-3'(沈Q IDNO.3);
[0012]LO:5'-CCCTTCATCGAAAGAGTAGGC-3'(沈Q IDNO. 4)。
[0013] 所述利用多重PCR鑒定西洋參的方法包括如下步驟：
[0014] (1)采用常規(guī)方法提取待測(cè)樣品的DNA，然后采用本發(fā)明所述的多重PCR引物對(duì)對(duì) 待測(cè)樣品的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] 所述多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 y L PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：5XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus) 5.0yL，dNTPs mixUire (2. 5mM)3yL，鑒別引物對(duì) 1(2 yM) 2 yL，弓I 物對(duì)2(2. 5yM)lyLPrimeSTAR服DNA Polymerase燈akara，2. 5U/yL)0. 25yLDNA模板 1. 0y以無菌雙蒸水補(bǔ)充體系至25 yL ;
[0016] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的參數(shù)如下：95°C預(yù)變性3min，98°C變性10s，50°C退火15s， 72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸7min，4°C保存；
[0017] 似電泳所述擴(kuò)增產(chǎn)物，若待測(cè)樣品獲得兩條分子量約為400bp和150bp大小的特 異帶型，則確定待測(cè)樣品為西洋參。
[0018] 本發(fā)明構(gòu)建了特異性多重PCR引物對(duì)1和引物對(duì)2,由于人參、西洋參及S屯基 因組高度相似，要尋找其差異DNA片段是一個(gè)難點(diǎn)，因此本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)從兩個(gè)方面著 手，引物對(duì)1是根據(jù)捜索Genbank中人參、西洋參、S屯的psbA-tr址基因序列（登錄號(hào)： 冊(cè)112864 ;冊(cè)112888 ;冊(cè)112884)，根據(jù)其變異區(qū)設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，引物對(duì)2是在前期 實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過RATO標(biāo)記篩選特異性片段（SEQIDNO. 7)，對(duì)其特異片段進(jìn)行回收、TA 克隆和測(cè)序，獲得了差異性DNA序列并根據(jù)測(cè)序序列設(shè)計(jì)特異性引物，該序列是通過RAPD 技術(shù)篩選獲得的特異性DNA片段，此前并未公開報(bào)道。
[001引下面進(jìn)行列舉：
[0020] -、西洋參、人參、立屯鑒別引物所錯(cuò)定的序列具有種內(nèi)高度保守的特點(diǎn)，且=者 之間存在較小的差異：
[0021] 1.人參、西洋參和=屯分別在NCBI進(jìn)行Blast相似度比較，具有高度的相似度， 95%W上，差別極小。
[0022] 人參和S屯序列Blast比較，相似度96 %。
[0023] 西洋參和S屯序列Blast比較，相似度95%。
[0024] 二、在西洋參、人參、S屯鑒別引物設(shè)計(jì)的過程中，前期一共設(shè)計(jì)了 20余對(duì)引物試 圖能將西洋參、人參、=屯鑒別出來，在引物設(shè)計(jì)從兩方面設(shè)計(jì)，一是采用一對(duì)引物進(jìn)行鑒 另IJ，二是采用多重PCR的方法進(jìn)行鑒別?，F(xiàn)略舉數(shù)例W作說明引物設(shè)計(jì)的艱難篩選過程： [00巧]1UP5, -GGGATATCGGATAAACCAAACAACT- 3,（SEQIDNO. 8)
[0026]LO5, -TCGGATAAACCAAACAACTCTACAAAC-3,（SEQIDNO. 9)
[0027] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人參、西洋參、S屯各2個(gè)樣本，無特異條帶。
[0028] 采用hkarafrimeSTAR服DNAPolymerase)熱啟動(dòng)酶，人參、西洋參、S屯各2 個(gè)樣本，退火溫度54°C，無特異條帶。
[0029] 2UP5' -GTCCCGACGAGATAGCCGAA- 3'（SEQIDNO. 10)
[0030]LO5, -GTCCCGACGATAATGAATATTTTATAACCA-3'（SEQIDNO. 11)
[0031] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人參、西洋參、S屯各2個(gè)樣本，無特異條帶。
[0032]采用l'akara(P;rimeSTAR服DNAPolymerase)熱啟動(dòng)酶，人參、西洋參、S屯各 2 個(gè)樣本，退火溫度54°C;人參、西洋參出現(xiàn)相同的條帶，所W，不能鑒別西洋參。
[0033] 3UP5, -CGCCCTTCTCATAAGATGTTGTAAGCTAC- 3,（SEQIDNO. 12)
[0034]LO5' -CCCTTCATCGAAAGAGTAGGCGGT-3'(沈QIDNO. 13)
[0035] 采用l'akara(P;rimeSTAR服DM Polymerase)熱啟動(dòng)酶，人參1個(gè)、西洋參1個(gè)、 =屯2個(gè)樣本，退火溫度54°C;西洋參和=屯出現(xiàn)相同的條帶，而且擴(kuò)增出很多雜帶，所W， 無特異條帶，不能鑒別西洋參。
[0036] 4義用Takara(P;rimeSTAR服DNAPolymerase)熱啟動(dòng)酶，選擇兩對(duì)引物一起擴(kuò) 增，人參、西洋參、=屯各2個(gè)樣本，退火溫度54°C;人參、西洋參出現(xiàn)相同的條帶，而且擴(kuò)增 出很多雜帶，所W，無特異條帶，不能鑒別西洋參。
[0037] 引物對(duì)1:
[0038]UP5, -TCCCGACGAGATAGCCGAAGACTTAACA- 3,（SEQIDNO. 14)
[0039]LO5' -CTCGCTTTCATTTTCGTTTCCAACTCCC-3'(沈QIDNO. 15)
[0040] 引物對(duì)2
[0041]UP5' -CTAGTTTCTTTAAATAAATTTAAAAAAAAC- 3'（SEQIDNO. 16)
[0042]LO5, -CCCCCTACTATTCTTTTTTC-3'（沈QIDNO. 17)
[0043] 5多重PCR方法建立的難點(diǎn)是該體系中各因素的確定，特別是各對(duì)引物的濃度比 例和穩(wěn)定性的摸索，本申請(qǐng)方法是經(jīng)過多次摸索和條件優(yōu)化而確定最優(yōu)反應(yīng)體系。W下略 舉：
[0044]=水平=因素正交實(shí)驗(yàn)（設(shè)計(jì)見表1)
[0045]表