猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的rt-lamp檢測(cè)引物組、試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)病原的檢測(cè)方法，具體設(shè) 及一種猴逆轉(zhuǎn)錄病毒（SRV)的RT-LAMP(ReverseI'ranscriptionandLoop-mediated IsothermalAmplification,反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)）檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 猴逆轉(zhuǎn)錄病毒（SimiantypeDretrovirus,SRV)，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、腫瘤病毒 亞科的D型病毒。SRV具有逆轉(zhuǎn)錄病毒所共有的特性，是單鏈RNA病毒，內(nèi)含逆轉(zhuǎn)錄酶，病毒 顆粒呈球形，直徑80-lOOnm，囊膜上缺乏明顯的纖突，感染細(xì)胞漿內(nèi)的病毒為A型顆粒，細(xì) 胞外未成熟病毒的核屯、為圓形，成熟病毒的核屯、為圓柱狀。病毒W(wǎng)出芽的方式從細(xì)胞膜上 釋放。SRV可在多種猴的細(xì)胞包括猴的B細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、唾液腺上皮細(xì)胞、膜腺 細(xì)胞等中生長(zhǎng)。SRV為猴艾滋病的主要病原體之一，.感染后臨床上表現(xiàn)為頑固性腹瀉、體 重減輕、全身性淋己腺病脾腫大、貧血、中性白細(xì)胞減少、淋己細(xì)胞減少、壞死性口炎、腹膜 后纖維瘤病等。
[0003] 到目前為止，發(fā)現(xiàn)感染SRV病毒并產(chǎn)生猴艾滋病的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物主要是雜猴屬 的動(dòng)物。近年來(lái)，已有SRV感染人的報(bào)道。SRV必須通過(guò)直接接觸才能在猴間進(jìn)行傳播， 主要通過(guò)猴間相互撕咬使含于唾液中的病毒進(jìn)入傷口而傳播，而在所有的分泌物和排泄物 中，唾液含病毒量最高。SRV也能通過(guò)性傳播和經(jīng)胎盤傳播。SRV對(duì)不同年齡的猴致病性有 差異，3歲W上的猴抵抗力較未成年猴強(qiáng)，6個(gè)月至2歲半的猴最易感，6個(gè)月W下的猴有母 源抗體的保護(hù)。雄猴和雌猴均易感染，但雌猴的病例較多。
[0004] SRV已經(jīng)被確認(rèn)為是導(dǎo)致SAIDS的病原體，因此，在猴艾滋病動(dòng)物模型建立之前一 定要排除運(yùn)種病原體的干擾。SRV感染的診斷除了檢查臨床癥狀，還要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷方 法，常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有PCR法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)法、間接免疫巧光（IFA) 法、免疫印跡(WB)法、病毒分離法等。PCR法快速、靈敏，但其擴(kuò)增產(chǎn)物需要進(jìn)行再一次驗(yàn) 證。病毒分離需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，周期長(zhǎng)、對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求高，因此，該方法不適合一般的檢 。目前，對(duì)SRV的檢測(cè)常用ELISA法和IFA法作為初篩，還必須用WB檢測(cè)特異性抗體才 能最終確診。ELISA法和IFA法檢測(cè)的假陽(yáng)性率高及WB法操作程序復(fù)雜，在一定程度上限 制了其應(yīng)用范圍。因此，不論是為了保障整個(gè)猴群的健康還是飼養(yǎng)人員、科研人員的人身安 全，都有必要建立一種方便、快捷、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT-LAMP檢測(cè)引物組。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法。
[000引本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種用于快速檢測(cè)猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT-LAMP檢測(cè)引物組，其包括一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi) 引物，其核巧酸序列分別如下所示： 外引物：
[0009] 一種用于快速檢測(cè)猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其包括上述檢測(cè)引物 組。
[0010] 進(jìn)一步的，所述猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒中，外引物、內(nèi)引物的摩爾比 為 1 :8。
[0011] 進(jìn)一步的，所述猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒中還含有DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄 酶、RT-LAMP反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照、顯色液。
[0012] 進(jìn)一步的，所述DNA聚合酶為BstDNA聚合酶，所述逆轉(zhuǎn)錄酶為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
[001引進(jìn)一步的，所述RT-LAMP反應(yīng)液含有IOmM dNTP、IOX化ermo化1反應(yīng)緩沖液、 150mM M拆04水溶液。
[0014] 進(jìn)一步的，所述陽(yáng)性對(duì)照為含有目的基因片段的質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為DEPC水。
[0015] 進(jìn)一步的，所述顯色液含有750mM巧黃綠素和5mMMnClz的溶液。
[0016] 一種猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法，包括如下步驟： O待檢樣品RNA的提?。?2) 利用權(quán)利要求1的引物組對(duì)待檢樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)； 3) 結(jié)果分析：根據(jù)反應(yīng)液顏色變化判定結(jié)果，澄色為陰性，綠色為陽(yáng)性； 進(jìn)一步的，步驟2)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的25 反應(yīng)體系含有：SRV-F3 0. 2yM，SRV-B3 0. 2yM，SRV-FIP1. 6yM，SRV-BIP1. 6yM，RT-LAMP反應(yīng)液 12. 5"，DNA聚合酶8U，逆轉(zhuǎn)錄酶2.抓，待檢RNA1~10化g，顯色液2. 5y1，用DEPC水補(bǔ)齊到25y1 ;然 后于63~65°C反應(yīng)45~60min。
[0017] 上述檢測(cè)方法用于非疾病檢測(cè)或診斷。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果易讀等有益效果： O高特異性： 本發(fā)明根據(jù)猴逆轉(zhuǎn)錄病毒（SRV) (GenBank登錄號(hào)為M11841. 1)的主要包膜蛋白基因 (ecK)的部分序列設(shè)計(jì)了 4條特異性引物，應(yīng)用上述4條引物，擴(kuò)增祀序列的6個(gè)區(qū)域，6個(gè) 區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高，且非常穩(wěn)定，形成引 物二聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行； 2) 高靈敏度：最低檢測(cè)極限可達(dá)到Ifg/y1含SRV目標(biāo)片段的質(zhì)粒DNA; 3) 快速高效：整個(gè)擴(kuò)增只用45~60min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)IO9~10 1°個(gè)拷貝； 4) 操作簡(jiǎn)便：不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄等繁瑣步 驟，只需要恒溫水浴鍋即可反應(yīng)，條件比較溫和； 5)結(jié)果易讀：通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)顏色變化即可判讀檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需電泳等其他任 何分析步驟，適合非專業(yè)人:t的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是實(shí)施例3特異性的檢測(cè)結(jié)果圖（1:SRVRNA;2:SIVRNA;3:HTLVRNA;4 : DEPC水對(duì)照）； 圖2是實(shí)施例4靈敏度的檢測(cè)結(jié)果圖（53￥0臟，1:100口邑/^1質(zhì)粒0臟61?￥);2:10口邑/ 質(zhì)粒DNA(SRV) ;3:Ipg/質(zhì)粒DNA(SRV) ;4:IOOfg/質(zhì)粒DNA(SRV) ;5:IOfg/ 質(zhì)粒DNA(SRV) ;6:lfg/yl質(zhì)粒DNA(SRV) ;7:0.1fg/yl質(zhì)粒DNA(SRV) ;8:DEPC水對(duì)照）。
【具體實(shí)施方式】
[0020] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0021] 實(shí)施例1猴逆轉(zhuǎn)錄病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒的建立 猴逆牽專錄病毒的RT-LAMP(ReverseTranscription曰ndLoop-mediatedIsotherm曰I Amplification,反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)）檢測(cè)試劑盒，包括RT-LAMP引物組、RT-LAMP 反應(yīng)液、化迅NA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照、顯色液。
[0022] (1)RT-LAMP引物設(shè)計(jì)：W猴逆轉(zhuǎn)錄病毒（SRV)的主要包膜蛋白基因（ecK)為祀基 因，利用軟件在線設(shè)計(jì)SRV特異性R